【摘要】 结核病是一种慢性呼吸道传染病，开展分子流行病学研究对于全面了解结核病在人群的传播模式，结核分枝杆菌的发生和进化过程具有重要意义。近年来，分枝杆菌多位点数目可变串联重复序列分析（MIRU-VNTR）、间隔区寡聚核苷酸分型技术（Spoligotyping）是比较常用的基因分型技术，而伴随着全基因组测序技术的广泛应用，可以更精确地鉴定结核分枝杆菌的流行传播规律。国内文献主要聚焦在结核分枝杆菌和耐药结核分枝杆菌分子流行病学特征的研究，以及不同基因分型技术在结核病分子流行病学中的应用，为制定结核病科学防治策略提供重要依据。

【关键词】 结核分枝杆菌；分子流行病学；基因分型；传播；耐药

分子流行病学是应用先进的技术测量生物学标志的分布情况，结合流行病学现场研究方法，从分子或基因水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并研究疾病的防治和促进健康的策略和措施的科学。本文对2018年国内结核病分子流行病学主要的研究进展进行总结。

一、结核分枝杆菌的分子流行病学

结核分枝杆菌基因组DNA的基因分型技术是研究结核分枝杆菌分子流行病学的重要基础，国内应用分型技术研究结核分枝杆菌在不同地区的流行与传播取得以下进展。

Xu等 ^[1] 通过MIRU-VNTR分型技术对苏北地区流行的临床分离株进行鉴定，并探讨了其传播方式。对连云港市连续收治912例经培养确诊的肺结核病例菌株，利用15个位点的MIRU-VNTR分型对分离株进行基因分型。利用亨特-加斯顿判别指数（HGDI）对分子标记的识别能力和多样性进行了评价。结果在741株成功基因型分离株中，144株（19.43%）形成46个簇，而597株（80.57%）具有独特的MIRU模式。所有15个基因座的总HGDI为0.999。平均集群规模为3（2～13）名患者。近期传播的估计比例为13.34%。结论认为，最近结核病在研究地点传播的概率相对低，而这些病例主要是由先前的感染激活引起的，空间分析表明形成较大集群的菌株具有区域聚集特征。

Shi等 ^[2] 使用26位点（经典24位点和其他2位点）的MIRU-VNTR和Spoligotyping对来自2015年期间河南省不同地区的668株结核分枝杆菌分离株进行分型分析。对结核分枝杆菌Spoligotype类型和耐药表型的相关性进行分析，结果发现河南省结核分枝杆菌具有高度的遗传多样性。河南地区结核分枝杆菌优势菌株是北京基因型（83.53%， n =558），其中典型北京基因型为主要亚型。668株结核分枝杆菌通过26位点VNTR被分为567个不同的基因型，其中包括38个簇（每个簇包含2～15株菌）和529个独特的基因型。北京基因型与性别、年龄、治疗史无关，但与4种一线药的耐受性和耐多药表型密切相关。针对本次研究的样本，根据Hunter-Gaston分辨力指数，26个位点中15个位点具有高度或适中的分辨能力。10个分辨能力最强位点的组合分辨力能与26位点相当。结果表明，北京基因型是河南地区最主要的流行菌株，并且建立了适宜于河南省菌株分型的10位点组合。

Liu等 ^[3] 基于1 189株北京地区收集的结核分枝杆菌菌株，利用Spoligotyping的方法区分北京基因型和非北京基因型，以及分析北京基因型是否与结核耐药性相关。结果表明，北京地区的主要流行的结核分枝杆菌菌种是以北京基因型为主，占所有菌株的83.3%。北京基因型菌株在男性及45～64岁人群中的比例显著高于对照组，非北京基因型结核分枝杆菌与异烟肼耐药相关。

厦门大学Zeng等 ^[4] 开发了一种基于熔解曲线的Spoligtyping技术，通过对DR区域的分析，结果表明与传统杂交方法相比，一致率为98%，并且其操作简便性显著优于传统手工杂交法。吴培丰等 ^[5] 采用熔解曲线间隔区寡核苷酸分型（melting curve Spoligotyping，McSpoligotyping）技术对广东口岸结核分枝杆菌复合群（ MTBC ）主要流行菌株及输入性菌株的分子流行病学特征进行分析，广东口岸558株 MTBC 菌株基因分型，分型结果与SITVITWEB数据库进行比对，获取间隔区寡核苷酸国际型别（Spoligotype international type，SIT）编号，并用BioNumerics 7.6进行聚类分析。结果显示558株 MTBC 菌株共分为107种基因型，其中66种归属于8种基因家族及4种家系。谱系2和谱系4共占菌株总数的86.38%（482/558）。6个主要流行簇分别为SIT1、SIT53、SIT52、SIT50、SIT190和SIT19，其中SIT1为最大流行簇。17株输入性 MTBC 包含北京、拉丁美洲和地中海等多个基因家族，其中包含23.53%（4/17）的新基因型。分析认为，北京基因型菌株耐药率为27.25%（106/389），非北京基因型菌株耐药率为23.81%（40/168），差异无统计学意义（ χ ² =0.72， P =0.40）。典型北京基因型菌株耐药率为26.03%（95/365），非典型北京基因型菌株耐药率为45.83%（11/24），差异有统计学意义（ χ ² =4.46， P =0.03）。结论认为，广东口岸以谱系2和谱系4 MTBC 为主要流行菌株，输入性菌株以来源地区流行的基因家族和新基因型为主，应加强对主要流行菌株及输入性菌株的分子流行病学监测。非典型北京基因型菌株与耐药性具有相关性。

一项来自上海地区的分子流行病学研究中纳入了2009—2015年1 211名上海松江地区流行结核病患者分离的菌株，并对其进行VNTR和SNP分型，结果表明与结核病患者空间距离较近的人群之间传播的风险显著高于空间距离较远的人群。同时存在流动人口和常住人口之间的结核病传播，这些研究结果提示空间数据与流行病学数据的整合有利于全面理解结核病的传播规律 ^[6] 。复旦大学Liu等 ^[7] 通过分析中国具有代表性的4 578株结核分枝杆菌菌株，发现99.4%的菌株属于谱系2和谱系4，提示当代流行的菌株大约在1 000年前进入中国，并且经过12世纪和18世纪的两次扩张，衍变成中国当代主要流行株。

二、耐药结核分枝杆菌的分子流行病学

中国一项通过大序列多态性和15个位点可变数重复串联对全国耐药结核病调查中获得的3 929株菌株进行了基因分型，结果发现2 905例（2 905/3 929，73.9%）属于谱系2，主要分布在东部和中部地区；975例（975/3 929，24.8%）属于谱系4，在西部地区流行率较高；36例和13例分别属于谱系3和谱系1。通过logistic回归探讨了谱系（谱系2与谱系4）与临床特征之间的关系。对于谱系2，患者危险因素为汉族人群和发热。然而，对于谱系4，患者危险因素是职业（农民）和教育程度（非文盲）。充分了解结核分枝杆菌谱系的分布及其危险因素，对结核病的预防、控制和治疗具有重要意义 ^[8] 。

罗东等 ^[9] 调查了江西省耐多药结核分枝杆菌MIRU-VNTR分子特征及传播情况。对分离自江西地区的耐多药结核分枝杆菌131株，采用15位点MIRU-VNTR进行RD105片段缺乏（北京基因型）检测进行分型，计算等位点差异、分辨率、成簇率以及近期感染率的估算值。结果表明，江西地区人感染耐多药结核分枝杆菌中北京基因型占83.21%。分离株结核分枝杆菌15位点MIRU-VNTR的HGI值为0.994 7，北京家族菌为0.992 3。131株菌共分为11个基因簇和98个孤立基因型，成簇率为25.19%，近期感染率估计值为16.79%；北京家族株成簇率为28.44%，近期感染率估计值为19.27%。结论认为，15位点MIRU-VNTR对包括北京基因型结核分枝杆菌的分辨率高，该方法适合于江西地区耐多药结核分枝杆菌的基因分型，江西省耐多药结核病的流行主要为内源性复燃，但近期传播仍不能忽视。

李妍等 ^[10] 对陕西87例耐药结核分枝杆菌进行分型研究，以了解不同基因型在陕西的流行情况及耐药相关性。通过收集陕西省结核分枝杆菌耐药菌株87株，采用Spoligotyping方法对结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型。结果表明，87株耐药结核分枝杆菌中北京基因型占86.21%（75/87），非北京基因型占13.79%（12/87）；非北京基因型中，T基因型（T1、T2、T2～3、T3）占9.20%（8/87），Manu基因型占1.15%（1/87），新发现基因型占3.45%（3/87）。北京基因型和非北京基因型的单耐药、多耐药、耐多药、其他类型的耐药比率分别为38.67%（29/75）、13.33%（10/75）、42.67%（32/75）、5.33%（4/75）和66.67%（6/9）、11.11%（1/9）、22.22%（2/9）、0（0/3），差异均无统计学意义（ P >0.05）。结论认为，陕西省结核分枝杆菌呈基因多态性，其主要流行基因型为北京基因型；北京基因型和非北京基因型的耐药性差异无统计学意义。

三、不同基因分型技术在结核病分子流行病学中的应用

段琼红等 ^[11] 综述了MIRU-VNTR方法应用于耐多药结核病分子流行病学的情况，认为MIRU-VNTR方法是一种简单快速的结核分枝杆菌基因分型方法，与其他分型方法结合，表现了与“金标准”RFLP相似的分辨力，已逐渐成为耐多药结核病分子流行病学研究中的重要工具。MIRU-VNTR主要应用于以下方面：①探索耐多药结核病传播机制；②接触者调查和暴发同源性调查；③区分再感染与复燃；④揭示结核分枝杆菌菌种多样性和群体遗传关系；⑤与GPS结合，描述各地结核病传播风险“热点”地图；⑥预测结核分枝杆菌耐药性。

陈昕昶等 ^[12] 对全基因组测序技术的研究方向及成果进行回顾，提出其局限性并展望其应用前景。认为传统的分型方法如基于IS6110的限制性片段长度多态性、间隔区寡核苷酸分型、分枝杆菌多位点数目可变串联重复序列分析的基因组信息仅为全基因组的1%以下，全基因组测序可以鉴定菌株间的单核苷酸多态性，可以通过SNP鉴定其传播方向和传播链，观察到结核分枝杆菌的微进化与传播；还可根据SNP的差异和缺失可以将结核分枝杆菌菌株分为几个主要的谱系，明确 MTB 的宏观进化与种系发生；还可用于结核分枝杆菌耐药相关突变的检测，通过全基因组关联性分析（GWAS）研究SNP与表型之间的关系的研究已有多篇发表。总之，全基因组测序技术已经大大提高了分辨率，推进了分子流行病学的研究，可以更好地监控结核病传播和鉴定传播源头；但现有的研究异质性很高，不同研究采用不同测序平台、分析流程等致使分析结果难以相互比较。

近年来分子流行病学研究结果显示，我国结核病近期传播率高，耐多药结核分枝杆菌（ MTB ）的外源性传播是导致我国MDR-TB传播和难以控制的原因之一。杨松等 ^[13] 对 MTB 基因分型及技术种类、国内 MTB 基因多样性与地理分布、世界其他地区 MTB 基因多样性与地理分布、 MTB 耐药及其与 MTB 基因多样性的关系等内容进行了综述，认为全球许多国家或地区流行的 MTB 基因型存在多样性，广泛流行的北京基因型与耐多药性可能有关，该种系可能更易发生耐药基因突变。不同国家和地区 MTB 、MDR菌株基因型及其耐药基因突变特点存在地理差异和基因多样性，MDR-TB或XDR-TB患者中分离的北京基因型和非北京基因型对一线、二线抗结核药物的耐药存在多样性。HIV感染增加了 MTB 耐多药发生率和MDR-TB传播。未来 MTB 基因多样性及其与耐药性的关系研究定会更加深入和进展，为耐药结核病防治提供更多信息。

（刘一典　梁晨　逄宇　唐神结）

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