第六节
液体样本的制片

细胞学制备方法的选择基于样本的物理特性、患者的病史资料，以及与病变有关的临床资料。制片（slide preparation）时细胞样本经程序化处理，使黏液、红细胞和炎症细胞与上皮细胞分离，制片薄且分布均匀。一般取材满意的样本均能制出质量较佳的细胞学涂片，但不同原理的制片方法也各有其优点（表1-4）。因此，制片时应根据不同的原理选择不同的方法，做出高质量的涂片。

（1）如果样本体积很小，肉眼外观清澈，细胞数量少，细胞制备的方法宜选择薄层液基细胞制片、细胞离心法制片。

（2）如果细胞样本混浊，初步离心后有沉淀形成并且镜下细胞丰富，可采用传统直接涂片、薄层液基细胞制片、细胞离心法制片、细胞块组织切片（图1-2）。直接涂片后立即用95%乙醇固定涂片做巴氏染色（PAP染色），或涂片空气干燥后做DQ染色等。

（3）如果细胞样本含血液，初步离心后未见沉淀形成，则使用溶血固定液。溶血后的样本可做传统直接涂片、薄层液基细胞制片、细胞离心法制片、细胞块组织切片。

（4）如果细胞样本含黏液，加入溶黏液溶液。细胞沉淀亦可做直接涂片、薄层液基细胞制片、细胞块组织切片。

一、传统的直接涂片

将未离心的液体样本，或离心后的细胞沉淀直接涂布于玻片的一端2/3处，另1/3处用于粘贴标签；单向涂布，避免细胞变形；细胞涂布均匀，厚薄适当。红细胞或黏液过多的涂片，可酌情进行溶解红细胞或黏液处理。

1. 涂片方法（图1-3）

（1）涂抹法。用棉签或针头将细胞样本单向、均匀地涂抹于载玻片上。

（2）拉片法。将细胞样本滴在一张载玻片上，再用另一张载玻片叠加其上，轻轻地将两张载玻片反向拉动，从而获得两张涂片。

（3）推片法。将细胞样本滴在一张载玻片的右端，再用另一张玻片作为推片，两者形成25°～30°夹角，先自左向右移动玻片到接触液体样本，然后自右向左匀力推动液体样本，形成涂片。这只是几种推片方法中的一种。

2. 细胞黏附　细胞黏附到玻片的程度依赖于细胞的类型及其状况，也取决于实验室接收样本时细胞的状况。有黏附能力的细胞，如大多渗出物，能很好地黏附于清洁空白玻片，而黏附能力较弱的细胞，如尿液、脑脊液等样本，就需借助磨砂玻片或黏附剂预包被的玻片。包被的方法有多种。

（1）磨砂载玻片。与普通载玻片比，磨砂载玻片更有助于细胞黏附到玻片表面。

（2）多聚赖氨酸包被。多聚赖氨酸均匀地涂在玻片上或将玻片浸泡在多聚赖氨酸溶液内。

（3）蛋白化玻片。将少量白蛋白均匀地涂在整张玻片上，可增加玻片表面的黏性，有助于更多细胞黏附到玻片表面。这种方法的缺点是涂片染色后白蛋白倾向于着蓝色。蛋白化玻片应提前几周准备并保存在密封容器内，如果玻片包被蛋白后急于使用，整个蛋白层和细胞就会在固定和染色过程中脱落。

（4）细胞本身被蛋白化。液体样本内加2～3滴白蛋白溶液，混合，然后离心、涂片。

（5）胺基烷基硅烷 [ 3 ] （aminoalkylsilane）处理。用于涂片原位杂交研究。清洁玻片浸入丙酮，干燥，然后浸泡在2%胺基烷基硅烷溶液（溶解丙酮）内，再用蒸馏水冲洗涂片，在60°C下干燥30分钟。

二、湿制备

湿制备是一种简单快速的检查方法，用于对未固定的液体样本的制备。取1滴样本和1滴甲苯胺蓝染液（甲苯胺蓝0.5g，95%乙醇20ml，蒸馏水30ml）于玻片上混合，加上盖玻片，置于显微镜下观察。这种技术可用于观察液体样本的细胞数量以及有无异常细胞存在。根据细胞数量的多少、细胞类型、临床资料，再进一步确定使用哪种方法来制备细胞。湿制备简单易行，其用途如下。

（1）决定样本的细胞数量多少。

（2）决定用哪种方法制备细胞，如直接涂片、薄层液基细胞制片、细胞离心法制片、细胞块组织切片等。

（3）避免因恶性肿瘤细胞的存在使染色液污染。

（4）需鉴别诊断时可提供特殊染色。

（5）观察尿样本是否有结晶、管型存在（乙醇固定后，结晶和管型会消失）。

（6）决定是否使用溶血剂（肉眼未见明显血液但镜下有大量红细胞）。

（7）准备教学片。

三、薄层液基细胞制片（ThinPrep 2000制片机制片操作程序） [ 4 ]

薄层液基细胞制片已广泛应用于非妇科样本，其优点是涂片细胞均匀分布，分布范围小，背景干净，细胞结构清晰，具有足量的细胞成分；样本筛查简便、快速；同一样本可重复制作多张细胞涂片；细胞转移稳定可靠，玻片的黏附性更加均一；显著降低样本的不满意率。

1. 制片所需材料（图1-4A，1-4B）包括ThinPrep 2000制片机、PreservCyt溶液瓶、过滤膜、固定液瓶（盒）、已贴好标签的玻片、废物桶、卫生纸等；制片时戴上一次性手套，检查申请单、样本和玻片上患者的信息是否一致。

2. 制片步骤（图1-5）

（1）将新鲜液体样本离心后，去掉上清液。

（2）沉淀样本加入30ml CytoLyt溶液，混匀。尿液沉淀样本使用PreservCyt溶液（2∶1），或UroCyte溶液。离心600×g，10分钟，去掉上清液。

（3）将样本置于PreservCyt溶液瓶中，静置15分钟。

（4）检查ThinPrep 2000制片机是否通电、主菜单、模式。

（5）装上PreservCyt溶液样本瓶。

（6）装上过滤膜（专用于非妇科样本）。

（7）装上载玻片。

（8）装上固定液瓶。

（9）合上门，选择程序2并开始运行（在运行过程中，门一直处于关闭状态；如门被打开，运行程序将自动停止）。

（10）运行完成后，开门。移动固定液瓶，取出已制作好的涂片，置于染色支架上，并浸泡在固定液内。

（11）去除旧的滤膜、样本瓶，换上新的滤膜、新的载玻片、新的PreservCyt溶液瓶（含样品细胞），为新的样本的制备做准备。

四、细胞离心法制片

细胞离心法制片是通过离心直接在玻片上产生薄层细胞。细胞离心法制片是一种简便的方法，用于细胞数量少的样本，如脑脊液或尿液等。细胞离心时产生一个恒定的离心力，与玻片形成一定的角度，使细胞沉淀在玻片上，形成均匀分布的薄层细胞。不同制造商所设计的腔大小不等，为0.5ml至几毫升不等。离心所用的滤膜由硝化纤维素（nitrocellulose）、聚碳酸酯（polycarbonate）或其他物质组成。

细胞离心法制片的步骤如下（图1-6）。

（1）准备玻片夹、玻片（贴上标签）、滤膜、样品室。

（2）按次序将玻片夹、玻片、滤膜、样品室组装在一起。

（3）向样品室内加上3～4滴样本样品。

（4）将已组装好的玻片夹、玻片、滤膜及样品室装上离心机头离心，1500r/min，5分钟（离心速度见表1-3）。

（5）取出涂片，或立即置入95%乙醇内固定20分钟，PAP染色；或空气干燥后，DQ和Giemsa染色或其他染色。将滤膜和样品室丢弃入生物垃圾桶，玻片夹置入消毒液中消毒，备用。

五、细胞包块的组织切片

用于细胞形态学分析，以及辅助诊断，如免疫细胞化学染色、原位杂交及特殊染色。液体样本离心后形成的沉淀可直接包埋在石蜡内做组织切片，也可将沉淀包埋在琼脂、凝血酶或其他凝胶等物质内。细胞包块的制备可以有不同的方法，现在介绍一种供参考。操作步骤如下。

（1）将患者的姓名、样本号写在组织固定盒上。

（2）取30～50ml新鲜液体样本入离心管内离心，1500r/min，5～10分钟，去掉上清液。

（3）分别加3滴血浆和凝血酶于含细胞沉淀的试管内，使之与细胞沉淀物混合成软的凝块。

（4）将含细胞的软凝块转移于用生理盐水浸过的镜头纸上（lens paper）折叠后，放于组织固定盒内。

（5）10%福尔马林固定。

（6）放入与处理组织活检样本一样的组织处理机内脱水。

（7）常规石蜡组织包埋，切片，HE染色、免疫细胞化学染色或其他染色。

六、体腔液体样本的制备（含血液、富含蛋白的样本处理）

体腔液体细胞学检查是临床使用最多的诊断方法之一，除了检测有无间皮性肿瘤外，还可以检查有无转移性肿瘤，对临床的诊治具有重要意义。过去以直接涂片为主要方法，检查的准确性受到一定程度的影响。自从薄层液基细胞学技术应用以来，对胸腔积液、腹水、心包积液、滑囊积液及灌注液等的检测已取得了较为满意的结果。

每一种体腔液体样本被送检时均需放在不同的防漏容器内，并贴上标签。大多液体样本富含蛋白质，被乙醇固定会产生沉淀，从而影响细胞制备的质量。因此，送检的液体样本应尽可能新鲜、不固定。为保持液体样本不发生凝固，也可以加肝素。液体样本获得后应立即送至细胞实验室，如推迟送检，液体样本应放在冰箱内；或在样本中加入40%的甲醛（加入量为送检液体样本的1/5），或等量的50%乙醇生理盐水。根据诊断的目的、免疫学研究和微生物评估的不同，离心后的沉淀物可用来直接涂片、薄层液基细胞制片、细胞离心法制片或细胞块组织切片。

液体样本的量少则1～2ml，多则数百毫升。这些液体样本用塑料袋或瓶运送，都存在生物污染的问题，因而必须加倍小心。液体样本常含血液、黏液、炎症细胞、微生物、结晶、蛋白性物质或其他碎片，因而液体样本必要时需要进行溶血、溶解黏液、粗过滤等处理，从而减少其对细胞评估的影响。

1. 对于富含蛋白样本的处理　取新鲜样本30ml，离心，去掉上清液；细胞沉淀加30ml生理盐溶液，重悬，离心，去掉上清液。

2. 溶血处理 [ 2 , 5 - 6 ] 玻片上如果有太多血液，会影响细胞的观察，从而影响细胞的评估。下列几种方式可除去玻片上过多血液，或溶解液体样本的红细胞。溶血和固定样本的方法如下。

（1）Carnoy's固定液（新配制）。无水乙醇、氯仿、冰醋酸以6∶3∶1配制。改良Carnoy's固定液为95%乙醇、氯仿、冰醋酸以14∶5∶1配制，或95%乙醇、冰醋酸以14∶1配制，或95%乙醇、冰醋酸以6∶1配制。Carnoy's固定液是一种极好的核固定液和糖原的防腐剂。必须新配制，每次使用后就不再重复使用，否则它会形成盐酸。

方法：涂片置于95%乙醇内固定15～20分钟，置于Carnoy's固定液中10分钟，然后浸于95%乙醇内。或涂片置于Carnoy's固定液内3～5分钟，至涂片无颜色，然后浸于95%乙醇。

（2）Clarke's溶液。100%乙醇、冰醋酸以3∶1配制。

方法：涂片置于Clarke's溶液内10～15分钟后，浸于95%乙醇。

（3）2M尿素（120g/L蒸馏水）。涂片置于95%乙醇内固定5分钟，置于2M尿素内30秒；或涂片置于95%乙醇内固定15～20分钟，置于2M尿素内1分钟。

（4）CytoLyt溶液。CytoLyt溶液是一种以甲醇为基础的缓冲溶液，它可以溶解红细胞，溶解黏液，防止蛋白沉淀，室温下可维护细胞形态8天。

方法：① 30ml液体样本离心，去掉上清液。② 细胞沉淀加入CytoLyt溶液（9份CytoLyt溶液和1份冰醋酸的混合液）。③ 重悬，离心，去掉上清液。④ 如仍是血性，或显微镜观察仍有大量红细胞，重复上述步骤。⑤ 细胞沉淀可用于直接涂片、薄层液基细胞制片、细胞离心法制片、细胞块组织切片。

（5）CytoRich Red（Fisher Scientific公司）。CytoRich Red是一种以乙醇为基础的溶血性溶液，用于细胞和组织切片。其溶血处理的步骤如下（图1-7）：① 将30ml含血液、未固定的液体样本，放入30ml CytoRich液中，与CytoRich Red以1∶1混合，倒入离心管。② 离心，1800r/min，5分钟，去掉上清液。③ 加CytoRich Red固定液15ml，重悬细胞沉淀。④ 静置15～30分钟。⑤离心，1800r/min，5分钟，去掉上清液。⑥ 细胞沉淀可用于直接涂片、薄层液基细胞制片、细胞离心法制片、细胞块组织切片。

（6）皂素（saponin）溶液。

1%皂素溶液配制：1.0g皂素、0.2g对羟基苯甲酸钠、100ml蒸馏水，充分混合，8µm滤膜过滤。

3%葡萄糖酸钙溶液配制：3.0g葡萄糖酸钙、0.2g对羟基苯甲酸钠、100ml蒸馏水，充分混合，8µm滤膜过滤。真菌容易在这种基质中生长，应注意。

方法1：① 将含血液的液体样本倒入离心管，离心，3000r/min，10分钟，去掉上清液。② 用30ml平衡盐溶液重悬细胞沉淀。③ 加5滴皂素溶液，轻轻摇动1分钟。④ 加15滴葡萄糖酸钙溶液，终止皂素酶的作用。⑤ 充分混合，离心，如仍含血液，或显微镜观察仍见大量红细胞，重复上述步骤。

方法2：① 将含血液的液体样本倒入离心管，离心，3000r/min，10分钟，去掉上清液。② 用25ml Hank's平衡盐溶液重悬细胞沉淀，充分混合，加Hank's平衡盐溶液至45ml。③ 加2ml 1%皂素溶液，混合，轻轻摇动1分钟。④ 加3ml葡萄糖酸钙溶液，终止皂素酶的作用。⑤ 充分混合，离心，3000r/min，10分钟，如仍含血液，重复上述步骤。

七、呼吸道样本的制备（含黏液样本的处理）

呼吸道样本包括痰液、支气管洗刷物、支气管肺灌洗液及针吸细胞样本等。这些样本可分别收集于CytoLyt溶液或平衡盐溶液中。呼吸道样本含有黏液，使用Saccomanno固定液或CytoLyt-DTT溶液溶解黏液，有助于样本的制备。

1. 痰液样本　包括常规清晨痰、支气管吸痰、药物诱导痰。痰液含有大量的黏液、呼吸性上皮细胞和（或）巨噬细胞（“尘细胞”）。任何被送到实验室的新鲜未固定的痰样本，都要立刻处理，以防止这些样本出现细胞变性。痰液样本含有细菌，放入冰箱不应超过24小时，因为即使在冰箱内细菌也可生长，从而增加实验室工作人员暴露的危险和细胞降解概率。在室温下如超过4小时，痰液应固定，常用固定剂为70%乙醇。

痰液直接涂片细胞学检查是早期诊断肺癌的重要方法之一，患者无痛苦，容易接受。然而影响痰液阳性率的因素很多，包括医师凭经验挑取少量样本进行制片；人为的随机取样导致病变细胞不能准确地转移至载玻片上；细胞固定不及时；痰液内细胞成分混杂，杂质成分不能有效去除；涂片过厚，黏液和炎症细胞遮挡视野；坏死细胞碎屑较多，加之黏液的干扰，常将癌细胞包裹、掩蔽等。采样时必须小心使用镊子或棉签仔细挑选血丝、灰白色痰丝、透明痰液，这些性状的痰液可能含有癌细胞。

新鲜未固定的痰液样本直接涂在玻片上制成涂片，立即将玻片置于95%乙醇中，做PAP染色。在制片过程中，不要让涂片干燥，可以加少量生理盐水保证细胞材料在制片过程中的湿润和软化。已固定样本，如收集样本为制备好的玻片，置于95%乙醇中固定。允许细胞固定至少30分钟，长时间固定不会损伤细胞。从固定液中取出玻片，用蒸馏水或自来水冲洗15～20秒，玻片可以立即染色或空气干燥后染色。

痰液中含黏液直接影响细胞制片，痰液通过Saccomanno技术处理和二硫苏糖醇（DTT）溶液处理，以溶解黏液。处理后的样本可以做直接涂片、薄层液基细胞制片和细胞块组织切片。通过Saccomanno技术处理后肉眼可见痰液呈细颗粒状、均匀分布的外观。直接涂片后PAP染色，在显微镜下细胞均匀分布，可以清晰地看见一些来自腺癌的小细胞团。另外，小细胞癌的癌细胞倾向于广泛性散在分布，明显区别于传统方法处理的细胞样本的形状。痰液的薄层液基细胞制片镜下特点为：背景干净，杂质成分少；细胞均匀平铺，便于观察；能最大限度地收集到癌细胞成分，还可以根据需要制作多张细胞涂片，以备免疫细胞化学检查，或特殊染色之用。

2. 支气管冲洗、刷片、支气管肺灌洗　来自支气管的冲洗、刷片和支气管肺灌洗的工作在支气管镜室进行，医师完成涂片的制备，并立即置入95%乙醇内固定；或将洗刷物、灌洗物置入CytoLyt保存液瓶内，然后将样本送到细胞实验室。涂片做PAP染色或特殊染色；保存液内的细胞可做薄层液基细胞制片，或细胞团块组织切片，PAP染色、HE染色或特殊染色。使用DQ染色方法检测支气管冲洗液中的卡氏肺囊虫是一种可靠的、快速的方法，灵敏度达76%。支气管冲洗样本中常规PAP染色的灵敏度低，支气管肺灌洗液常规PAP染色的灵敏度可以得到改善；使用Grocott-Gomori methenamine银染色法和Cresyl echt（fast violet），加上DQ染色可以提高灵敏度。Gram-Weigert染色也是很好的方法。

3. 黏液样本的处理（图1-8）黏液样本的处理，包括Saccomanno技术处理痰液样本 [ 5 - 7 ] 和DTT溶液处理痰液样本 [ 8 , 9 ] 。

（1）取新鲜未固定痰液加入30ml Saccomanno固定液（50%乙醇，2%聚乙二醇），或30ml CytoLyt-DTT溶液（2.5g DTT，30ml CytoLyt溶液），混合。

（2）将混合液倒入搅拌机搅拌3～4分钟。

（3）将样本置入离心管，离心，1500r/min，10分钟。评估细胞沉淀，应为液体状，如不是液体状，再加CytoLyt-DTT溶液，重复上述步骤。

（4）去掉上清液，混合残留液和细胞沉淀。

（5）取细胞做传统直接涂片、细胞块组织切片，或将细胞沉淀转移至PreservCyt溶液瓶内，静置15分钟。

（6）薄层液基细胞制片。

八、尿液样本的制备

尿液细胞学检查是泌尿系统肿瘤普查的主要方法之一，近年来，由于细胞制片技术的进步，肿瘤检测的阳性率和诊断准确性均有大幅度的提高。有关资料和临床经验表明，尿中发现移行细胞癌可早于临床影像学或临床检查数月至数年。

尿液中的细胞悬浮在不利的环境中，细胞在离开机体时已变性。一旦细胞离开机体，其保存将会更加困难。因此晨尿和24小时尿均不推荐用于细胞评估。尿样本的制备应在收集样本的同一天进行，如样本的制备在收集样本的隔一天或隔一个周末进行，应加70%乙醇（两份尿一份乙醇）固定。样本置入冰箱可延缓细胞变性，但冷样本会形成盐结晶并堵塞滤膜孔，因而影响细胞的制备。故在样本制备之前，先将尿样本置于室温下，让盐结晶溶解。如果尿液收集在乙醇中，细胞将很难粘贴到玻片的表面，同时会使蛋白性的物质粘贴到细胞上。前者由于细胞倾向于变硬变圆，常见核固缩，需要用黏合剂将细胞粘贴到玻片上，因而妨碍样本的染色；后者因为蛋白性的物质浓染而遮盖了细胞，从而影响细胞的镜下观察。理想的细胞样本是由新鲜的细胞立即制备，离心后弃去上清液，沉淀物直接涂片或转移至PreservCyt保存液瓶内，做薄层液基细胞制片或细胞离心法制片，其结果是细胞保存良好、染色良好、丢失很少。如尿液含有胶状物时，应先将其除去，用0.5mmol/L氢氧化钠调节尿液pH至6.0，然后离心，去上清液，再向沉淀物中加入95%乙醇5～10ml，静置5分钟后加入蒸馏水并轻摇（溶去胶状物）；再次离心后，取沉淀物制作涂片。如由导管导尿，进行膀胱、输尿管和肾盂肾盏冲洗，由于使用润滑剂，细胞样本可能被过多的润滑剂遮盖，从而影响细胞的观察。

九、脑脊液样本的制备

脑脊液（CSF）的量一般较小，最小的体积为1ml，最理想的体积为2～3ml。脑脊液内细胞一般较少，但富含蛋白。因乙醇可使蛋白凝固，故脑脊液不做预固定。目前使用的细胞学制备方法有直接涂片、薄层液基细胞制片和细胞离心制片。如选择直接涂片，玻片上应加黏附剂，如多聚赖氨酸。

CSF涂片染色应单独进行，以避免与其他细胞涂片之间的污染。如所有CSF样本于同一天完成，制备人应避免样本之间的污染。对于来自患有克雅二氏病（Creutzfeldt-Jakob病，一种发生在人类身上的传染性海绵状脑病，分普通和变异两种。近年新的变种可能通过食用或接触患有疯牛病的病牛而感染）的患者样本的制备，在制备的过程中，包括一次性设备、容器或离心管及染色液和相关试剂等，使用后均要丢弃。如需要重复使用的物品，在清洁之前，应浸入5%次氯酸钠2小时（未稀释的家用漂白剂），或121℃高压消毒1小时。样本处理过程中被液体污染的表面，在常规清洁之前，应用5%次氯酸钠消毒2小时。

十、人工假象 [ 10 ]

1. 核模糊　如果样本收集于生理盐水、磷酸盐缓冲液（PBS）、RPMI 1640培养液内，细胞染色后，核会出现模糊不清的现象。为避免这一问题，应将样本收集于新鲜的CytoLyt溶液中。

2. “晕轮”假象　在一些样本中，仅滤膜边缘的细胞转移至玻片上，因而在玻片上形成“晕轮”或“环”。如细胞评估为不满意，将细胞样本按1∶20稀释，重复制片。

3. 挤压假象　有些样本制片后，玻片上细胞分布均匀，但分布在周边的细胞出现“空气干燥”样的假象，这其实是滤膜周边与玻片挤压的结果。

4. 染色假象　有些样本染色后显示类似“空气干燥”样的假象，即细胞团或一堆细胞显示红色或中央黄色、周边红色。这是由于对比染色不完全所导致的结果。解决的办法是乙醇脱色后再重新染色。

5. 圆筒体边缘人工假象　有些样本显示出在玻片上形成很窄的由细胞组成的边框，这个边框超越细胞正常分布区域的边界，这是由于样本细胞太多，由滤膜边缘转移至玻片所形成。 a7CGytrww+KA45TskkzwmBp0A9xgtaLtHEtsq5xe0vyVSgUnDpaNNpeZzFBLELjD