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FNA穿刺可以在触诊或超声的指导下进行。通过触诊进行穿刺的好处是成本低和快捷。超声指导的穿刺可以确保穿刺到那些可疑的结节，减少无效穿刺的数量，并提高诊断精确度。因此，对于那些触及不到的结节，有明显囊性成分的结节（>25%），以及先前进行过穿刺但样本不合格的结节应该在超声的指导下进行穿刺。无论通过触诊或辅助超声，穿刺技术实质上相同。
甲状腺血管非常丰富，为最大限度减少血肿的形成，建议使用25G或27G的细针。根据不同的情况和操作者的偏好，穿刺时可以同时加带注射器的抽吸。皮肤应使用酒精棉签擦拭干净。是否皮下注射利多卡因进行局部麻醉，应根据操作者的经验和患者愿望而定，不是必须的。超声指导的细针穿刺最好避免使用凝胶，因为凝胶可以掩盖正常的细胞学形态 ［ 13 ］ 。进行穿刺时细针在结节内反复抽动的频率大约在每秒3次。每次穿刺的时间最好控制在2～5秒，如果时间过长，针腔会被形成的血块堵塞。如果开始2次穿刺的细胞量持续偏低，可以加用注射器抽吸。但在穿刺针撤出结节之前，应该释放抽吸力。穿刺次数应视具体情况和结节的大小而定，通常建议3～5次 ［ 10 , 13 ］ 。穿刺并发症（如暂时血肿和结节梗死）并不常见，引发的感染则更为罕见。
穿刺后借助注射器内空气将细针内的样本推压到玻片上以制备细胞涂片。细针内残留样本可以通过冲洗收集在细胞悬浮液内，以便进一步制备离心涂片（cytospin）、液基（liquid-based）细胞学涂片（例如薄层涂片，ThinPrep or Sure Path），或细胞块（cell block）。薄层涂片的优点包括减少血细胞干扰和易于制备。样本结构（大滤泡和小滤泡）亦被保留。如果使用液基制片，一张薄层涂片就已足够 ［ 14 , 15 ］ 。薄层涂片和离心涂片应使用巴氏染色（Papanicolaou stain）。细胞涂片可以是酒精固定（巴氏染色）或空气干燥固定（Diff-Quik染色，亦即Romanowsky染色）。巴氏染色可以更好观察细胞核特点，如假包涵体、核沟和染色质质地。Diff-Quik染色更适合检测细胞外物质（特别是胶体和淀粉样物质）以及胞质的细节（如颗粒状物质）。