第五节
细针穿刺的样本制备及染色

一、直接涂片

在绝大多数情况下，直接涂片是细胞形态学分析的最佳样本制备方法。如制作恰当，细胞形态学分析所要观察的指标如细胞的大小、形状、细胞质及细胞核等都能在直接涂片上得到较好的呈现。细胞间的相互关系或结构特征如单个细胞或成团排列等也能在直接涂片上很好看到。有时在涂片过程中所产生的人工假象对细胞形态学分析也会有帮助。一些脆性较大的细胞核在涂片过程中因挤压而成条索状（nuclear streaming）是一种人工假象（图1-4），此假象常见于淋巴细胞和小细胞癌的样本。另外，穿刺样本中的一些背景信息如甲状腺胶质、黏液基质、坏死及炎症也都能很好地在直接涂片上显示。

直接涂片有多种方法，如一步法和二步法。一步法就是将穿刺样本放置于玻片上直接进行涂片（图1-5A～C）。二步法常用于那些被体液（如血液）稀释的样本，其制作方法是将样本放置于玻片上，将玻片侧放以去除过多的体液，然后以另一玻片收集其存留的颗粒性样本后再涂片（图1-6A～E）。

图1-7所示是一步法直接涂片法。按照此方法制作出来的涂片能将细胞呈现密度梯度的分布，因而在做形态学分析时总能找到一块细胞密度最佳的区域。此种涂片方法的操作关键在于涂片过程中必须保持两张玻片平行。根据样本的稀稠来决定是否应立即涂片。如果是偏液性的样本，在放置两张玻片后应立即涂片，以免液体形成的张力影响玻片的移动。而对较黏稠的样本，在两张玻片放置到一起后应稍停片刻，等黏稠的样本分散开些再涂片，以免制作的涂片过厚而影响细胞形态学分析。

二、液基样本

液基样本可作为直接涂片的补充。特别适用于量多而细胞稀少的穿刺样本，如囊性肿块的抽吸液。液基制备可以起到浓缩样本的作用。但液基样本在做细胞形态学分析时会有局限性：一是细胞在液基样本固定制作过程中会有一定程度的缩小，以致影响对细胞大小的准确判断；二是液基制作采用离心或过滤的方法，真正的细胞间的关系不易判别，在液基样本中看到的细胞成团现象有可能只是制备过程中造成的假象。另外，一些背景信息如较稀的基质、黏液或坏死等在液基样本上也不易看清。

残留的液基样本还可以用来做一些辅助检查，如可以制作新的液基片用于特殊染色或免疫细胞染色。另外，液基样本还可以用来做分子病理学的分析，如检测基因突变。

三、固定和染色

在涂片制作完毕后，需要进行固定和染色才能用于细胞形态学分析。常用的染色分析包括Diff-Quik染色、巴氏染色及HE染色。

Diff-Quik染色

涂片制作后需经自然干燥才能用来做Diff-Quik染色。此染色方法非常快速、简单，故常用于现场细胞学的分析。Diff-Quik染色对细胞质的特征如颗粒、空泡、包涵体等辨识度较好。另外，基质、黏液、甲状腺胶质等也能被较好地辨认（图1-8）。

巴氏染色

巴氏染色是妇科脱落细胞学中最常用的染色方法，也同样广泛地应用于细针穿刺细胞学中。用于巴氏染色的涂片在制作好后应立即放置于95%的酒精中，因为干燥所造成的假象会影响细胞形态学的分析。巴氏染色最大的好处在于能够很好地呈现出细胞核的形态学特征，如核膜的光滑度、染色质的粗细、核仁的大小以及核内包涵体。另外，此染色方法能很容易地辨认细胞质的角化情况，这对鳞状上皮细胞癌的诊断尤其重要（图1-9）。

HE染色

涂片如需做HE染色则必须在制作好后立即放置于95%酒精中固定。HE染色也能较好地呈现细胞核的形态学特征（图1-10）。但细针穿刺样本中的血性成分往往会对细胞形态学的观察造成干扰。

关于Diff-Quik染色、巴氏染色及HE染色的比较详见表1-1 ^{［ 12 , 13 ］} 。

四、细胞蜡块的制作

穿刺得到的部分样本和穿刺针冲洗液、血块或组织碎块等可以用来制作细胞蜡块。细胞蜡块可以作为补充进行形态学分析，还可用于一些辅助检查，如特殊染色、免疫细胞化学及分子病理学检测。特别需要指出的是免疫细胞化学检查，尽管此检查也可以在直接涂片或液基样本上进行，但细胞蜡块可以提供多张具有相似细胞（量及结构）的切片，方便应用于那些需做多种指标检测的样本；并且细胞蜡块上所做的免疫细胞化学类似于组织切片，通常背景清晰，很少有非特异性的染色，故细胞蜡块是免疫细胞化学检查的首选样本类型。

用于细胞蜡块制作的样本需先经过固定。常用的固定液有配制的细胞固定液、50%酒精和4%福尔马林。样本经固定后可采用人工血凝块法或琼脂/组织胶法来制成细胞蜡块。

人工血凝块法

（1）固定好的样本需进行离心沉淀，去除所有上清液。因为固定液中酒精或福尔马林可能会抑制人工血凝块的形成。如有必要，可用生理盐水多次冲洗离心沉淀物。

（2）将离心沉淀物与血浆充分混合。所加血浆量的多少应视沉淀物的大小而定，一般来说加几滴即可。

（3）加入与血浆相当量的凝血素（50U/ml），并充分混匀，一般1～2分钟形成血凝块。

（4）将形成的血凝块用镜头纸包好，放置于小标本盒中，像组织标本一样处理。

琼脂/组织胶方法

（1）将琼脂/组织块预热至40～50℃。所用的琼脂浓度为3%。组织胶则够量即可使用。

（2）将固定好的样本进行离心沉淀，去除上清液。

（3）将预热好的琼脂/组织胶与沉淀物混合好。注意不能将混合物过度搅拌，最好形成粗块。让沉淀物自然冷却，使其质地变硬。

（4）将变硬的混合物用镜头纸包裹好，放置于小标本盒中，像组织标本一样处理。 rRMkcsd8F6Ii9WD9BgvND5du3gHSvcgSepB5tpXTowharsOYt2PwS4ADoesYBDTW