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班超字仲升，扶风平陵（今陕西兴平东北）人。从小勤奋好学，思路敏捷，能言善辩，胆识过人，志向高远，不拘小节。永平五年，哥哥班固被召任兰台令史，他与母亲也随兄前往洛阳（今属河南）。
由于家境贫寒，班超常常替官家抄书以供家用。天长日久，非常辛苦。一次，他扔下手中抄书南笔，仰天长叹道：“大丈夫应有大的志向，应当像傅介子、张骞那样为国建功立业，来获取封侯的地位，怎能总是这样没完没了地抄书呢？”旁边的人听了这话，都取笑他。班超说：“你们这班平庸之辈哪里了解壮士的胸怀！”
永平十六年（公元73年），奉车都尉窦固奉命讨伐匈奴，聘班超为代理司马。这支队伍出酒泉，西北至天山，大败匈奴呼衍王，并攻占了伊吾（今新疆哈密）。班超在蒲类海打了一仗，大胜而归。窦固认为他很有才能，便派他与身为从事官的郭恂一起出使西域（今敦煌以西地区）。
班超一行人到了鄯善国（今新疆若羌县境），国王盛情款待，礼节周全。但是没多久，鄯善国王对班超一行人忽然变得疏远、怠慢起来。见此情形，班超对他的部下说：“你们感觉出鄯善王的态度有变化没有？我想这一定是匈奴派了使者到鄯善来威胁国王，所以国王犹豫不决，无所适从，才这样冷淡我们。聪明人能在事情处于萌芽状态时觉察其征兆，何况目前的事情已十分明显了。”于是他叫来侍者，出其不意地问道：“匈奴使者已经来了几天了？现在在什么地方？”侍者立刻惊慌失措，只好把事情的原委一五一十地交代出来。
班超听后，把这名侍者关了起来，然后召集三十六名随从人员一起饮酒，待大家酒兴正浓时，故意拿话激怒他们说：“大家和我同处在这极其边远的地方，为的是想建立大功，谋求富贵。现在匈奴的使者才来几天，鄯善国王对我们便怠慢起来。如果现在国王把我们抓起来送到匈奴，我们只会落得个抛尸荒野，葬身豺狼之腹的下场。各位，怎么办？”大家齐声说：“今天，我们身处危亡之地，不论是死是活，都跟着您干。”班超说：“不入虎穴，焉得虎子。就目前的形势看，我们只有主动出击，夜间用火攻战术，这样，匈奴使者就不知道我们究竟有多少人马，必定大为惊恐，我们便可乘机全部消灭他们；鄯善国人必定会闻风丧胆，我们便可大功告成了。”众人说：“应当与从事官商量一下。”班超说：“是吉是凶就看今天。从事官是个文弱书生，对我们的计划帮助不大。而且这件事宜快不宜迟，如果我们的计划泄露，大家也会遭到灭顶之灾。这样不明不白地死去，哪还算是个壮士！”大家一起说：“好！”
天一黑，班超便带领众随从直奔三十里外的匈奴使者住处。当夜正好刮大风，班超命令十个人手持战鼓藏在匈奴使者下榻的房舍后面，约定道：“大家一看见火起，就一起击鼓大喊。”又让其余的人张弓搭箭在帐篷门两边埋伏下来。他自己在上风将所有帐篷一一点着。众人见火起，一齐呐喊。帐篷内的匈奴使者惊慌失措，纷纷冲向门外。班超手起刀落砍倒三人，众人一呼而上，把冲出门外的三十多人的头砍了下来，其余一百多人都被烧死。
第二天，班超回来把事情经过告诉郭恂，郭恂一听大惊失色，过了一会儿才回过神来，缄默不语。班超心知其意，拉着郭恂的手说：“您虽没随我们前往，我班超哪会有居功独占的想法呢？”郭恂这才高兴起来。班超于是请来鄯善国王，把斩下的匈奴使者的头颅给他看，国王大为震惊。班超于是好言抚慰，劝其归附汉朝，不再投靠匈奴。鄯善王一一答应，并决定将自己的儿子送到汉朝做人质，表示与汉结盟。班超回到窦固那里报告了情况，窦固一听非常高兴，把班超的功绩一五一十向朝廷作了汇报，并请求另派人出使西域。汉明帝十分赞赏班超的勇敢与果断，下诏给窦固说：“像班超这样的官吏，你为什么要另换人而不让他继续出使呢？现在，我任命班超为你属下的军司马，让他继续出使西域。”于是班超继续向西进发。
班超在西域活动长达三十一年，使西域五十多个国家重新归属到东汉的管辖之下。永元七年（95），汉和帝下诏书，封班超为“定远侯”。