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19世纪90年代时，约翰·D·洛克菲勒也走到了他人生的十字路口。在已经度过的漫长的几十年中，他一直在拼命挣钱，积累了一大笔财富——这笔财富是以亿万来计算的。但现在他更加忙碌，不仅要管理他的业务，还要安排他的投资和慈善事业。
事实上，洛克菲勒的捐钱行善早在他年轻时就开始了。这与他的宗教信仰联系在一起的。他笃信基督，曾经长期在克利夫兰和纽约的基督教浸礼会担任领袖。宗教活动在他生活中仅次于经商大事。最初，他只施舍几角几分给教堂，年复一年，随着他收人的增加，他的捐款数额也大了起来。不过，这些捐助和洛克菲勒的巨额收入相比，捐助的款项不成正比。据统计，到19世纪80年代末以前，共捐出十几万美元。
1890年之前，美国只有哈佛大学和约翰·霍普金斯大学等几所大学。90年代以前，随着社会的进步，人们生活条件的改善，求知欲增强了，因此大学教育蓬勃发展起来。斯坦福大学、克拉克大学以及芝加哥大学都是这个时期创建的。考虑到自己的捐款太零散，于是，洛克菲勒在一些教会人士的建议下，萌生了兴建大学的念头。
1888年，浸礼会的教育团体在华盛顿开会，一致通过了盖茨的建议，兴办大学的事就此展开。
筹备工作分别由盖茨、古特史壁、哈珀三人负责。他们各有分工，各展才华，盖茨负责筹款，管理基金，古特史壁负责游说西部的人士支持该校及公共关系方面的事宜，哈珀则策划校方的课程及师资方面的事。
1889年5月18日，浸礼会终于在波士顿的提蒙礼拜堂召开大会。首先由史强先生宣布在芝加哥要创办一所学院，接着盖茨便宣读了洛克菲勒的来信，告诉教友们他将捐助60万美元作为建校的基金，希望抛砖引玉招来更多的捐款，共同创建这所学校。
教友们纷纷响应洛克菲勒，数日之内又收到30多万美元，半数以上是教友捐赠，其他是由商人及芝加哥以外的人士捐的。
1889年9月10日芝加哥大学成立，9月18日董事会推举哈珀出任校长。
对洛克菲勒来说，那笔60万美元的捐款不过是第一步。以后，他源源不断地向这所学校投入资金，支持他们度过难关，但他坚持10年以后，学校必须自给自足。10年中，他的捐款总额达到34000多万美元。
洛克菲勒不但捐款，而且在学校创办的过程中，不辞辛苦地帮助招聘各种最好的人员，但他并不想管理这所学校，也不想借这项事业使自己扬名。大学建成后，他只访问过校园两次，直到他去世后，学校才把一幢建筑以他的名字命名，即洛克菲勒纪念礼拜堂。
这是洛克菲勒慈善事业的第一个百万级的伟大工程。而和兴办芝加哥大学有着同样重要意义的是他从中发现了一位人才，此人就是弗雷德里克·T·盖茨，后来成为洛克菲勒的新同事，而他所起的作用，不亚于洛氏在石油事业上的任何一位亲密同事。
90年代开始，洛克菲勒从千头万绪的工业领域开始投身于慈善事业这个新领域时，就像钻进了荆棘丛生的树林中，到处是请求他慷慨解囊的各种书信，尽管他当时被舆论描绘成石油恶魔，但飞向百老汇26号的乞求信件却可用斗量车载。
洛克菲勒不得不在百老汇26号设立了一个专门班子处理这类信件。其中4/5的内容是私人要求捐助，另外1/5的请求来自各地的慈善团体、宗教和市民组织及其他机构。要分清这里面哪些是值得捐助的，哪些是不值得捐助的，需要相当大的精力、时间去分析研究。洛克菲勒想找到一套制度和管理原则，使慈善事业变成一项有效的事业，最大限度地处理好他个人的财产。
这时，他认识了盖茨。从1888年盖茨呈送给美国浸礼会教育团的那份出色的报告起，便引起了洛克菲勒的注意。他认真地观察了他三年，他看到了盖茨身上许多令人钦佩的东西，他有头脑有主见，精神饱满，生气勃勃。
盖茨对于慈善事业的理想，是渴望建立一个规模巨大的慈善托拉斯，足以与洛克菲勒创建的那个标准石油托拉斯匹敌，而且这个机构在赠与金钱方面的制度，也同标准石油公司在石油界所做的一样。盖茨想借助洛克菲勒的巨额资产，一步一步实现这一理想。
1897年，盖茨回纽约州乔治湖度假时，认识了一位在医学院求学的年轻人。通过他，盖茨了解到了许多医学知识和医学界的情况，并阅读了经典著作《医学原理与实践》。书中讲到如何诊断100多种不同的疾病，但却极少讲到如何治疗这些病。盖茨的结论是，只有1％的病例大夫知道如何治疗，对其他90％的病例，他都没有什么办法，只能听天由命。当时的美国，医学发展落后，远远赶不上欧洲先进国家。法国有巴斯德研究所。德国有高呵研究所，而美国：却根本投有这类医疗研究中心。盖茨感到，很需要设立一个医学研究中心，以提高整个医学界的水平，造福世人。
回来后，盖茨口授了一份备忘录送给洛克菲勒，正在寻求“要害”的洛克菲勒很高兴，他几乎马上同意了这个建议。
1901年底，在7位著名医生的共同努力下，在美国成立了第一个医学研究机构——洛克菲勒医学研究所。
研究所的工作开始进行得不太理想，因为研究目标不明确，加上资金不足，人手不齐，没有多大进展。于是这些医生请求洛克菲勒扩大研究范围，增加资金。洛克菲勒答应再增添100万美元改组研究所。这次选出魏尔奇医生的学生西蒙，弗莱克斯纳为研究所领导，并向全国招收优秀的医疗科学人才。
1904年，成立了新改组的医学研究中心，在弗莱克斯纳的带领下进行医学研究工作。1906年，洛克菲勒在东河的66街买下一幢大楼，作为研究中心的办公室。在那里工作的科学家组织起来，分为病理学、生理学、药剂学及生物学四大部门，其研究远远地走在了时代的前列。
1908年至1910年，研究所再度改组，从简单的小研究所扩展成现代化的大型研究所，只好把研究部门与财务部门分开。由洛克菲勒、盖茨、小洛克菲勒及墨菲等人专门成立了董事会来管理财务及行政，让研究所的科学家们专心从事研究，不必为杂务所困扰。洛克菲勒只管向医学研究提供资金，很少干涉研究活动，他鼓励研究人员放开手脚，大胆研究，不计成果。
在那个年代，研究所的科学家们成绩卓著，他们共获得了12项诺贝尔奖，比其他任何一个研究所获得的荣誉都多。还有，该研究所还拥有全世界最先进的设备。洛克菲勒先是提供了100万美元兴建了一幢实验室大楼，后来又花几百万美元设立了第一个医院和实验室的综合机构。医院设有60个病床及9个病床的隔离房。他们只收那些正在研究中的病历的病人，免费为他们治疗。后来，研究所又增设了动物病理学部门和植物病虫害部门。到了50年代，该研究所在纽约的大楼共有11座。
洛克菲勒的另一项慈善事业——洛克菲勒卫生委员会的成立，纯属偶然。1908年，当罗斯福总统在位时，南方的人民普遍生活清苦，且大部分人患有一种钩虫病。美国公共卫生署的查尔斯·斯蒂尔斯大夫在钩虫传染病方面已工作多年，他曾一再呼吁人们重视钩虫的危害——它是导致南方各州棉花工厂的工人中广泛流行的嗜睡症的病因，而且受这种病影响的人数高达几百万人洛克菲勒卫生委员会于1909年诞生。
委员会成立后积极开展预防和治疗钩虫传染病。起初，他们的工作在南方被人嘲笑，但坚持不懈的努力取得了辉煌的成就。这一卓有成效的工作使洛克菲勒受益匪浅，人们对洛克菲勒的名字的态度，发生了进一步重大的转变，这正是洛克菲勒想要的。
对于已经成立的几项大的慈善事业，医学研究所、普通教育委员会、卫生委员会，洛克菲勒还不十分满足。他想开创一项永久性的慈善事业，其捐款数目及影响，都要超越以前的几项慈善事业。盖茨曾向洛克菲勒建议，不仅在国内开展慈善事业，而且要把这一事业推向国外，推广世界性的医学研究及全球性的基督教义以增进人类身体和心灵的健康。
筹备工作进行了大约5年。然而，这一次时运不佳。当时，联邦政府正在对洛克菲勒的标准石油公司提出诉讼，反托拉斯法的浪潮正高，许多人都怀疑洛克菲勒的居心不良，另有企图。怀疑者还指出，洛克菲勒的这些捐助时机是经过精心选择的，他在1907年对普通教育委员会提供的一笔3200万美元的捐款，恰好是在兰迪法官对标准石油公司处以罚款的时候。而现在捐献5000万美元，又是在标准公司的律师们就解散标准托拉斯的诉讼案向最高法院提出辩护前几天。从时间上看，人们的怀疑的确有道理。
洛克菲勒只好先废弃了他原先的捐款，但他成立基金会的决心却没有动摇。他又向纽约州申请特许，由于该州的立法人士并不十分挑剔，于是在1913年5月，洛克菲勒轻易地在该州通过了特许，成立了洛克菲勒基金会。洛克菲勒拨出一亿美元供这个基金会使用。
基金会在成立后的几年时间里，发展成一个国际性机构，大力参与各种国内外的救助工作和教育运动。