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色谱是分离、提纯和鉴定有机物的重要方法之一。色谱法的分离效果远比分馏、重结晶等一般方法好，特别适用于少量（微量）物质的处理，在化工、化学、生物、医药等领域得到了广泛的应用。
色谱是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解（分配）性能的不同，或各组分亲和作用的差异，使混合物流经该物质，进行反复的吸附或分配等，从而将各组分分开。因此色谱有两个相：固定相和流动相，根据组分与固定相的作用原理不同，可将色谱分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱等。根据操作条件的不同可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱和高效液相色谱等。
柱色谱，又称柱上层析，常用的有吸附柱色谱和分配柱色谱。前者常用氧化铝和硅胶作固定相；后者则以硅藻土、纤维素等为支持剂，以吸收的液体为固定相，支持剂本身不起分离作用。
吸附柱色谱（图2-24）通常是在玻璃管中装入一定的固体吸附剂，被分离物则被吸附在柱的顶端，当洗脱剂流下时，由于不同化合物的吸附能力不同，便以不同的速度下移，于是形成不同的层次，将混合物分离开来。
吸附柱色谱常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等，颗粒大小均匀。一般说来，吸附剂颗粒越小，表面积越大，吸附能力越强，但洗脱剂的流速越小。因此颗粒大小应该根据具体分离需要确定。大多数吸附剂都能强烈地吸附水，而且水不易被其他物质置换，从而使吸附剂的活性降低（通常用加热的方法使吸附剂活化）。
图
化合物的吸附能力与其极性成正比，即化合物中含有极性较大的基团，其吸附能力就较强。氧化铝对有关物质的吸附能力按以下顺序递减：
酸和碱>醇、胺、硫醇>酯、醛、酮>芳香族化合物>卤代物、醚>烯>饱和烃
洗脱剂，即溶剂，它的选择关系着分离效果。通常情况下，根据被分离物中各组分的极性、溶解度和吸附剂的活性来选择。一般来说，洗脱剂的极性越大，洗脱能力就越大。常用洗脱剂的极性由小到大的顺序是：
己烷、石油醚<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸
在具体进行柱色谱分离时可分为以下步骤：
①装柱。可以采用湿法和干法。目前一般采用下有砂芯的玻璃管作色谱柱，湿法装柱方法如下：向柱中加入3/4的洗脱剂，打开活塞，控制流出速度为1滴/s。通过一个干燥的玻璃漏斗慢慢加入色谱用氧化铝或硅胶，同时用木棒轻轻敲打柱身，当装柱至3/4时，再加一层石英砂或一小片滤纸。注意：装柱和装样品、洗脱均不能使液面低于沙子或滤纸的上层。色谱柱要求填装均匀，不能有裂缝或气泡。
②装样品。首先将样品溶解于一定的溶剂中，溶剂的极性尽量小，体积尽量小。当洗脱剂刚好流至石英砂或滤纸上面时，将样品溶液沿柱壁加入，当此液面将至石英砂（或滤纸）面时，立即加入少量的洗脱剂洗下管壁上的被分离的物质，如此2~3次。
③洗脱。在装好样品的色谱柱上安装滴液漏斗，向漏斗中倒入洗脱剂，控制流出速度为1滴/s，进行洗脱。对于复杂系统一般可进行梯度洗脱，即慢慢改变洗脱剂的极性（由小到大）。收集洗脱液时，简单的方法是根据颜色的不同来改变接收瓶，一般是每接收一定的体积更换接收瓶，然后根据薄层色谱来确定样品组成。
④浓缩收集样品。根据薄层色谱结果将相同组成的样品并在一起进行蒸馏以蒸除洗脱剂。当快蒸干时，将样品转移至蒸发皿中，在水浴上蒸干或用红外灯烘干。
薄层色谱是一种快速而简单的、分离微量物质的色谱法。薄层色谱兼备了柱色谱和纸色谱的优点，特别适用于挥发性较小，或在较高温度下易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。薄层色谱也有吸附色谱和分配色谱两种。
常用薄层色谱吸附剂也是氧化铝和硅胶，与柱色谱不同的是，这里常用硅胶H（不含黏合剂）、硅胶G（含有黏合剂煅石膏）、硅胶HF254（含荧光物质），可在254 nm紫外光下观察荧光、硅胶GF254（含有煅石膏和荧光物质）。同样，氧化铝也有相应的品种。
薄层色谱的分离原理与柱色谱类似，其操作步骤如下：
①制备薄层板。将吸附剂和水调成糊状，然后均匀地涂在干净平整的玻璃片上，再将涂好的玻璃片放在水平的平台上晾干，最后将干透的玻璃片置于烘箱中加热活化（活化时需要慢慢升温）制成薄层板。硅胶板在110℃左右活化30~60 min，可得Ⅳ~Ⅴ级活性的薄层板。氧化铝薄层板在200~220℃时烘4 h，可得Ⅱ级活性的薄层板；在150~160℃时烘4 h，可得Ⅲ~Ⅴ级活性的薄层板。所制得的薄板应该均匀、没有裂缝。将符合要求并活化的薄板置于干燥器中保存备用。
②点样。在薄层板上距一端约1 cm处，用铅笔轻轻画一条线。将样品用低沸点溶剂配成1%的溶液，并用管口平整且内径小于1 mm的毛细管吸取样品溶液，轻轻接触起点线，如果溶液太稀，可待溶剂挥发后重复点样。点样斑直径一般不超过0.3 cm，若多处点样，点样距离为1 cm左右。
③展开。薄层的展开需在封闭容器中进行，展开剂的选择与柱色谱吸附剂的选择一样，主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性来考虑，展开剂的极性越大对化合物的洗脱力越大。如图2-25所示，将展开剂放入展开槽，使槽内溶剂蒸气饱和5~10 min，再将点好样的薄层板垂直或倾斜放入展开槽中。当展开剂前沿上升到离薄层板顶端1 cm处时取出薄层板，用铅笔或小针画出溶剂前沿，放平晾干。
④显色。如果用的是有荧光的氧化铝或硅胶，可在紫外光下观察，并标出斑点；或将薄层板置于碘缸中显色。根据斑点位置计算比移值Rf，如图2-26所示。
图2-25 薄层色谱展开示意图
图2-26 薄层色谱比移值的确定
Rf随有机物结构、固定相与流动相的性质、温度等因素的变化而变化。当温度等实验条件固定时，比移值是一个常数，可作为定性分析的依据。但是由于影响Rf的因素很多，实验数据往往与文献记载不完全相同，因此在鉴定时常常采用标准样品对照分析。