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徐东 金锋
中国医科大学附属第一医院
雌激素作为一类重要的性激素，在女性一生的正常生长发育和病理状况中起着至关重要的作用。从女性的周期性子宫内膜脱落到乳腺癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤的产生均有它的参与。而提到三阴性乳腺癌，首先都会想到ER（-），PR（-），HER-2（-）。但随着技术的发展，我们认识到其中的ER所指的仅仅是ERα66，实际上部分三阴性乳腺癌还是会表达ERβ，ERα36，以及一种新型的雌激素受体G蛋白耦联受体（GPR30或GPER-1）等。而且三阴性乳腺癌中还存在着雌激素产生的重要关键酶——芳香化酶。所以就需要我们对雌激素与三阴性乳腺癌的关系进行重新认识。
Kuiper等在1996年发现了一种与经典的ERα不同的雌激素受体，即ERβ，其同样可介导雌激素对细胞的作用，尤其在ERα阴性的乳腺癌中，其作用得以凸显。ERβ基因位于14号染色体长臂2区，共有8个外显子。ERβ蛋白由530个氨基酸残基构成，与ERα亚型相似，均有A-F6个功能结构域，它们在C区和E区均有高度的同源性，C区为DNA结合区域，E区则是配体结合区域。在研究中发现ERβ蛋白也存在不同的亚型，主要是由外显子在转录翻译中产生的氨基酸序列差异所致。ERβ发挥作用的经典机制是与ERα受体二聚化形成异源二聚体形式，再与雌激素受体反应元件结合而引起下游的转录启动。这种二聚体形成的作用机制和对下游的作用是一致的。而在另外的非经典途径中，ERα和ERβ均可与一些转录因子结合组成复合体，从而启动基因的转录调控。但在这种机制中特别是通过如AP1位点的信号转导中，ERβ和配体结合后产生的效应与ERα的作用是截然不同的，ERβ和配体雌激素结合后引起AP1位点下游的抑制，而ERα则通过该位点对基因的转录产生激活作用。
法国的Roger P等研究了对乳腺良性疾病，乳腺原位癌及他们对应的病灶旁正常乳腺组织进行了研究。发现ERβ在正常乳腺组织上皮及非增生性乳房良性疾病中表达率约85%，明显高于无不典型增生的增生性乳房良性疾病及原位癌，而ERα则相反。在增生性乳房良性疾病中ERβ表达水平下降，预示着其中ERα的表达水平升高，在有不典型增生的乳房良性疾病中更加明显。而且良性疾病的病灶旁组织中ERβ表达水平也明显高于浸润前疾病的病灶旁组织。ERβ表达与Ki67负相关，再加上其他一些证据，表明ERβ在癌前病变中起对抗雌激素有丝分裂活性的作用。
美国学者也进行了类似的研究，发现ERβ在正常乳腺组织中表达率为94.33%，在导管上皮增生性病变中则明显下降至76.67%，DCIS中为70%，浸润性癌中约60%。表明随着恶性进程的变化，ERβ表达水平逐渐降低。
在使用他莫昔芬治疗乳腺癌的研究中显示ERβ1表达与预后良好显著相关，ERβ2不影响预后。在性激素受体阴性或三阴性乳腺癌中，ERβ1表达阳性的患者使用他莫昔芬治疗拥有更好的预后。
ERβ有五个亚型，在人乳腺癌中存在的主要是1，2，5。目前研究主要集中在1和2亚型上。但研究结果存在争议以及矛盾之处。
我国学者对ERβ在乳腺癌中的表达情况进行了meta分析，其中6769例乳腺癌中ERβ1表达与乳腺癌的5年DFS和OS均存在正相关，而ERβ1mRNA表达则与两者均无相关。2295例乳腺癌中ERβ2表达与5年DFS正相关，而与OS无关。ERβ5表达与DFS无明显相关。亚组分析提示无论ERα表达如何，ERβ1均预示着更好的5年DFS，但只有在ERα阳性的情况下，ERβ1表达才会预示更好的5年OS。
我国学者检测了571例三阴性乳腺癌的ERβ1表达情况，有30.1%的TNBC存在ERβ1过表达，且更倾向于表达在绝经后患者，是TNBC较好预后的独立预测因子。研究发现ERβ1抑制TNBC的作用可能是通过影响PTEN/PI3K/Akt通路而实现的。
日本学者检测了81例三阴性乳腺癌中ERβ、17β-HSD1、2、6，芳香化酶及AR的表达及其相互关系，提示雌激素在TNBC中起潜在的保护作用。
在细胞生物学水平的研究也同样提示ERβ对TNBC的抑制作用。MDA-MB-468细胞系中，ERβ1可使细胞周期停滞于G1期，从而达到抑制细胞生长的作用，并且该效应可通过使用雌激素而更加增强。在该细胞系的动物实验中，ERβ1可抑制肿瘤的形成与生长，使用雌激素可使肿瘤快速退缩。
德国学者在TNBC细胞系HCC1806和HCC1937中使用ERβ的选择性激动剂甘草素和ERB-041能降低肿瘤细胞侵入基底膜的能力以及迁移能力。美国学者发现ERβ是通过降低EGFR的稳定性而抑制基底样乳腺癌细胞的EMT转化，从而导致其迁移、转移能力的降低。
而且研究还发现氟维司群可上调TNBC细胞系MDAMB-231中ERβ的表达，进而抑制细胞生长。但这种抑制是通过细胞退化来完成的，并未出现凋亡等现象。
但也有截然相反的结论：ERβ1在MDA-MB-435细胞系中的过表达可促进细胞增殖，并在动物实验中可促进该细胞系增殖及转移，这些作用都是不依赖雌激素起作用的。后来在2007年Rae和2009年Lacroix经多方研究终于证实MDAMB-435细胞系来源于黑色素瘤M14细胞系。所以国际上600余篇以该细胞系进行三阴性乳腺癌的研究均被归入黑色素瘤研究中。
总之，ERβ在三阴性乳腺癌中与雌激素结合主要起的是抑制肿瘤增殖、迁移、转移等作用。但实际上ERβ并不是TNBC细胞上唯一能接受雌激素刺激的受体，还有一种新发现的G蛋白耦联的雌激素受体（GPER）也可以和雌激素结合。
GPR30是1997年Carmeci等在比较乳腺癌细胞MCF-7与MDA-MB-231细胞的基因表达时首次克隆出的。当时人们对这个受体的配体尚不知，称其为孤儿G蛋白耦联受体。直到2000年Filardo等研究发现：在GPR30（+）的MCF-7（ERα+/ERβ+）和SKBR3乳腺癌细胞系（ERα-/ERβ-）中，雌激素能够激活细胞外信号调节激酶1/2（extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2），而GPR30（-）的MDA-MB-231细胞中却不存在此现象。Filardo等将表达GPR30的载体转染至不表达GPR30的MDA-MB-231细胞中，使得该细胞获得了对雌激素的快速非基因组作用。这说明GPR30很可能参与了这个过程。通过此研究他们首次用遗传学手段表明了GPR30是一个新型的雌激素受体。GPR30为一类由375个氨基酸组成的7次跨膜受体，广泛地分布于乳腺癌、卵巢、胎盘、神经、心脏、前列腺、肝脏、血管内皮和淋巴组织细胞中。其基因定位于染色体7p22，总共包含7008个碱基对。
关于GPR30的细胞内定位目前尚存在争议，Funakoshi认为GPR30在细胞膜上表达，在雌激素的作用下可以转位至细胞质中。Revankar使用绿色荧光蛋白标记COS7细胞的GPR30后，发现免疫荧光标记的雌激素及其衍生物在内质网区域与GPR30结合，说明其主要定位于细胞内质网上。Prossnitz使用细胞内标记物研究也证实了GPR30于内质网表达，在与内质网连接的核膜上也有GPR30表达。氟维司群、他莫昔芬、环境雌激素、植物雌激素均可通过GPR30促进乳腺癌细胞的增殖，这也被认为是他莫昔芬耐药的重要原因。
GPR30被激活后，首先活化与其相连的G蛋白，使G αβγ 异三聚体解离为G α 和G βγ 而分别发挥作用。目前研究相对比较清晰的雌激素结合GPR30的细胞内通路有：
乳腺癌细胞中，雌激素激活GPR30后，G βγ 二聚体与G α 解离后，能激活Src家族酪氨酸激酶，促进基质金属蛋白酶（MMP）的激活等引起的肝素结合表皮生长因子（heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF）向胞外释放。而HB-EGF释放能激活EGFR，从而诱导了MAPK通路的激活，快速活化胞内的细胞外信号调节蛋白激酶（ERK），从而增加原癌基因c-fos表达，最终促进多种肿瘤细胞生长。
雌激素激活GPR30后，解离的G α 活化腺苷酸环化酶，使胞内cAMP增加，激活cAMP依赖的蛋白激酶A（PKA），使Raf-1失活，从而使ERK减少，进而调控细胞生长。
乳腺癌细胞中，无论ER表达状态，均观察到雌激素能够通过GPR30激活PI3K-AKT信号通路，促进细胞增殖。PI3K激活后引起磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸在细胞膜累积，随后通过它的特定结构域使抗凋亡促增殖激酶AKT激活。
活化的EGFR可动员钙池，使GPR30激活后出现了细胞内钙离子的快速增多现象。细胞内游离Ca 2+ 作为第二信使，其浓度的改变能调节细胞增殖、凋亡，运动以及基因表达等。
GPR30能够介导雌激素信号通路，促进人正常乳腺上皮细胞的增殖。德国学者的研究提示异常的GPR30表达是乳腺癌发生进程中的一个重要因素。
作为一种新发现的雌激素受体，在三阴性乳腺癌中也进行了临床相关研究。
美国学者在48例乳腺癌中检测了GPR30的表达，并研究其与乳腺癌生物学行为之间的关系，其中有18例TNBC，17例GPR30（+），并且揭示了GPR30表达与年轻乳腺癌及易复发相关。我国学者也有一些小规模研究，同样提示TNBC中GPR30的阳性率极高。而埃及的一项研究中所有的TNBC均不表达GPR30，可能由人种差异或抗体问题导致。
GPR30表达的位置不同对乳腺癌的生物学行为也会产生不同的影响。瑞士学者对981例浸润性乳腺癌进行了研究，发现胞浆GPR30表达型与高分化、Lumina型、分期早等相关。核GPR30表达型则与分化差、TNBC亚型存在相关。
在GPR30在三阴性乳腺癌的细胞学研究中，同样会有一些不同的声音，我国学者的研究表明激活GPR30可以通过抑制NFkB/IL-6信号途径而抑制TNBC的迁移及血管形成；德国学者进行的研究也表明GPR30在TNBC中起肿瘤抑制作用。但这两项研究均使用的是GPR30的激动剂G-1进行的研究，而不是其自然配体雌激素。且我国学者与美国学者共同研究表明G-1可以不依赖于GPR30的存在而抑制卵巢癌和乳腺癌细胞的增殖，所以目前看以G-1进行的GPR30研究，是否可以代表GPR30的自然功能还存在争议。但我们可以认为G-1可能作为TNBC潜在的治疗药物。
2005年Wang等研究者从人子宫内膜cDNA数据库和人胎盘cDNA数据库确认了一个5.4kb的cDNA克隆，其与ERα66基因的第2～6外显子完全重合，而且其转录启动是从此前未确认的存在于ERα66基因第一个内含子之内的启动子开始的。ERα36由310个氨基酸构成，与ERα66相比，其转录激活区均缺失（AF-1和AF-2），但仍保留了DNA结合区、二聚作用区以及部分配体结合区。在MCF-7细胞系中也在RNA和蛋白水平证实了内源性ERα36的存在。
研究者发现由于其结构缺陷，不管有无雌二醇存在的情况下，ERα36均无转录活性，但它能够强有力的抑制ERα66和ERβ的转录活性。其中原理尚未完全阐明，但根据推测可能有以下两方面原因：一方面，ERα36保留了DNA结合区，所以可以和其他ER一样结合至DNA的ERE区，竞争性的抑制了其他ER的结合，从而抑制了其他ER的转录活性；另一方面，ERα36拥有二聚作用区，可以和其他ER形成异二聚体，从而抑制其他ER的转录活性。在细胞系中也发现，转染ERα36质粒之后，会造成细胞浆内ERα66浓度升高。
ERα36与ERα66相比，能够接受更多种类的配体，包括：E1、E2α、E3、E4，甚至他莫昔芬和氟维司群，被认为和他莫昔芬的耐药有关。且高表达ERα36的乳腺癌患者，新辅助化疗效果欠佳，预后更差。
ERα36对三阴性乳腺癌也有促进增殖、转移、防止凋亡的作用，大约40%的三阴性乳腺癌中有ERα36的表达。其作用机制主要有：①ERα36接受雌激素刺激，激活MAPK/ERK信号通路，诱导c-Myc和细胞周期素D1基因表达，从而促进细胞增殖，加速肿瘤生长。②定位于细胞膜的ERα36接受雌激素刺激，迅速激活PKC，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。③ERα36接受雌激素刺激可迅速激活PI3K/Akt通路，从而促进癌细胞增殖。
芳香化酶是利用睾酮合成雌激素的限速酶，广泛存在于人体，在女性胎盘，脂肪组织及脑中含量较高，而在男性的支持细胞及睾丸间质细胞中含量较多。雌激素主要包扩来源于外周组织的雌酮，卵巢的雌二醇以及胎盘的雌三醇。在绝经后的妇女中，雌激素的主要来源为雄激素通过芳香化酶经三步脱氧脱氢氧化还原反应转化而来。在绝经前的女性中，雌激素主要通过卵巢合成。
文献报道芳香化酶在乳腺癌中表达的阳性率为52.6%～64.3%，且提示其表达与ER状态无相关性。在ER阴性的SKBR3细胞中，敲除芳香化酶后，导致细胞的生长增殖能力、克隆形成能力以及迁移侵袭能力均减弱。但缺乏更深入的机制研究。且芳香化酶能明显提高癌组织局部的雌激素水平，甚至在乳腺组织芳香化酶高表达的绝经后女性中，乳腺局部雌激素水平可能会超过循环雌激素的10倍，接近绝经前水平。存在表达芳香化酶的TNBC局部雌激素升高，通过GPR30和/或ERα36促进细胞增殖、迁移的可能机制。
目前在TNBC中芳香化酶与ERβ共同出现的文章仅一篇，但未探讨两者之间的相关性等问题。
在TNBC中，有学者研究发现雌激素可通过GPR30促进ERRα-1表达，而ERRα-1可结合至芳香化酶的启动子区域，故可促进芳香化酶的表达。
而ERβ与GPR30，ERβ 与ERα36，ERα36与芳香化酶，GPR30与ERα36之间的关系以及它们在TNBC中的共表达情况尚未见相关研究。
根据上述的研究，我们可以发现GPR30和ERα36的作用机制中有很多共通之处，也有人提出，二者之间是否存在协同作用，但目前尚需进一步研究的证据支持。
1）三阴性乳腺癌的发病特点是绝经前年轻患者高发，主要发病人群处于雌激素高水平的阶段。
2）在男性乳腺癌中三阴性乳腺癌仅占2.9%，远低于女性的15%～20%，二者的雌激素水平差距自是不言自明。
3）一例男性变成女性的变性人患者，发生了三阴性乳腺癌，这也可能和他口服大量雌激素维持女性特征有关。
4）年轻的三阴性乳腺癌患者在化疗期间使用GnRHa保护卵巢功能，发现明显的DFS获益，这可能与GnRHa客观上降低了患者的雌激素水平有关。
5）一项在551名BRCA1和BRCA2基因突变携带者中进行的研究，其中241人未进行预防性乳房切除，但其中99人进行了预防性的双侧卵巢切除，142人进行对照观察。发现手术组的乳腺癌发病率明显低于对照组。（21/99，21.2%，VS 60/142，42.3%）。而BRCA突变主要和TNBC的发生相关，也就是说降低雌激素水平使得TNBC发病率明显降低。
6）美国威斯康星州癌症研究网络利用ERβ和雌激素结合，在TNBC中抑制细胞增殖的特性，在17例转移性三阴性乳腺癌（13例ERβ（+），4例ERβ（-））中进行了大剂量雌激素治疗的2期临床试验，最终有1例患者出现了部分缓解，3例患者病情稳定，大多数病人都病情进展，甚至有2例出现了有症状的脑转移。该项研究最终因为未达到预期的临床获益而终止。实际上这项研究中，忽视了一个问题，TNBC可以表达GPR30、ERα36，也可以和雌激素结合，并促进癌细胞发生增殖，迁移等。
综上所述，我们可以提出一个假说：三阴性乳腺癌的发生发展也是和雌激素有关的，并大部分依靠雌激素驱动的。基于此，可以考虑在临床上开展针对三阴性乳腺的内分泌治疗研究。
根据TNBC表达雌激素受体的情况，建议分为ERβ型，GPR30、ERα36型，以及共表达型。根据分型不同使用不同的治疗策略。
ERβ型：可考虑雌激素治疗或使用氟维司群。
GPR30、ERα36型：阻断雌激素的治疗，可考虑使用AI、GnRHa等。
共表达型：参照GPR30、ERα36型。因为ERα36可竞争性抑制ERβ，GPR30是否对ERβ有抑制作用尚待研究证实。
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