二、薄层色谱

1.原理

薄层色谱又称为薄层层析，简称TLC（Thin Layer Chromatography），是色谱学中的一个重要分支。它是将固定相均匀地涂在薄板（玻璃板、铝箔、聚合物纤维软片等）上，然后点上试样，依靠毛细作用，使流动相通过固定相进行展开的一种层析方法。根据作用原理的不同，薄层层析分为吸附、分配、离子交换和凝胶过滤等种类，这里仅介绍吸附薄层层析。

薄层色谱是一种微量（样品量几微克到几十微克）、快速（几分钟到几十分钟）、简便的分析分离方法。它不仅适用于有机物的鉴定、纯度的检验、定量分析和反应过程的监控，而且还通常作为柱层析的先导者，即在柱层析之前寻找适宜的分离条件，确定洗脱液的组成；在柱层析过程中，用于监控洗脱分离的效果；在柱层析之后，用以洗脱液的鉴定和分类合并。特别适用于挥发性小或在高温下易分解而不能用气相色谱进行分析的物质。但这种方法的不足是不能进行大量物质的制备性分离。

吸附薄层色谱常用硅胶或氧化铝为固定相制成薄层板，将试样配成溶液点在板的下端，置于层析缸内，以展开剂为流动相进行展开。当展开剂在吸附剂上展开时，由于样品中各组分对吸附剂吸附能力的不同，发生了无数次吸附和解吸过程，吸附能力弱的组分（即极性较小的）随流动相快速向前移动，吸附能力强的组分（即极性较大的）移动慢。利用各组分在展开剂中溶解能力和被吸附剂吸附能力的不同，最终将各组分彼此分开。如果各组分本身有颜色，则薄层板干燥后会出现一系列高低不同的斑点（如图2-36所示），如果本身无色，则可用各种显色方法使之显色，以确定斑点的位置。在薄板上混合物的每个组分（即板上的一个斑点）展开后上升的高度与展开剂的前沿之比称为该化合物的R _f 值，又称比移值，见公式：

对于一个化合物在相同实验条件下，其R _f 值是确定的。但是在实验过程中，很难做到实验条件完全一样，因此，在鉴定化合物时，经常采用和标准化合物对照的方法。

薄层吸附色谱最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝。化合物的吸附能力与它们的极性成正比，极性大，则与吸附剂的作用强，随展开剂移动慢，R _f 值小；反之极性小的则R _f 值大，因此利用硅胶或氧化铝薄层色谱可把不同极性的化合物分开，甚至结构相似的顺反异构体也可以分开。各类有机化合物与上述两类吸附剂的亲和力大小次序大致如下：

羧酸＞醇＞伯胺＞酯、醛、酮＞芳香族硝基化合物＞卤代烃＞醚＞烯＞烷

2.操作

（1）硅胶薄层板的制备：薄层板制备的好坏直接影响到分离效果，吸附剂应尽可能涂得牢固、均匀，厚度约为0.25~1mm。实验室常用的玻璃板规格有5cm×10cm、5cm×20cm、10cm×20cm、20cm×20cm等。根据铺制方法的不同，薄层板的制备可分为平铺法、倾注法和浸涂法三种。制板前先要制备浆料。取适量硅胶加入一定量0.5％的CMC（羧甲基纤维素钠溶液，0.5g CMC沸腾下溶解于100mL蒸馏水中，冷却、静置24h以上，取用上层清液）溶液研出气泡，调成粘稠适宜的糊状物备用。

①平铺法：用购置或自制的薄层涂布器进行制板，见图2-37。

②倾注法：用骨匙将调好的浆料摊铺在玻璃板上，用手摇晃，然后放在实验台上，让一端接触台面，另一端轻轻跌落数次，互换板位置重复操作，然后放在水平的台面上晾干。

③浸涂法：将两块干净的玻璃板对齐紧贴在一起，浸入浆料，如CH ₃ Cl和硅胶浆料，浸入前先摇匀浆料，使玻璃板上涂上一层均匀的吸附剂，取出分开、晾干。

（2）点样：在距薄板一端1cm处（高于展开瓶中展开液高度）用铅笔尖轻轻画一横线作为起始线。将样品溶于低沸点溶剂配成1％左右溶液，用内径约1mm管口平整的毛细管，利用毛细作用吸取样品溶液后垂直轻轻点在起始线上（尽可能不要点在直线的两端，以减少边缘现象的影响）。若溶剂太稀，一次点样不够，可在同一位置重复点样，但每次点样后均要晾干才能再次点样。点样量不宜过多，原点不宜过大，应控制直径约为1~2mm，点样斑点过大，往往会造成拖尾、扩散等现象，影响分离效果。一块薄层板可以点多个样，但样品之间以1~1.5mm间距为宜。

（3）展开剂的选择和展开：展开剂的选择主要是取决于样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素。单一溶剂，常用的一元展开剂极性的大小次序如下：

己烷和石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸

实际操作中，往往难以选择到理想的单一展开剂，常选用2~3种溶剂组成的混合溶液作为展开体系（称为二元或三元展开体系）。经常用的二元展开体系有石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇等，应根据试样性质和层析的目的来选择不同比例的多组分展开体系，以取得较好的分离效果。

理想的展开剂应能使混合物分离后各组分R _f 值相差尽可能大，即展开后各组分斑点尽可能彼此远离。

薄层层析的展开需要在密闭的容器内进行。将选择好的展开剂倒入层析缸中使液面高度约0.5cm。为了防止边缘效应（溶剂前沿不整齐，成弧形），应把滤纸衬在层析缸（瓶）周围，将盖子盖紧，使缸内空间尽快地为展开剂蒸气所饱和。然后将点样后的薄层板用镊子放在缸内，点样的一端朝下，小心倾斜地浸在展开剂中（点样线应在展开剂液面之上）。盖好，即开始展开。当展开剂上升到预定位置（一般距板顶0.5~1cm）时，取出薄板，用铅笔标出前沿位置，晾干（或吹干）。如图2-38所示。

展开薄层除一般由下往上的上行展开外，对于组分较复杂的样品可采用单向多次或双向展开。

单向多次展开：如果用某种展开剂展开后，有些组分还没有完全分开，如在柱层析洗脱条件选择时（一般要求斑点最大R _f 值＜0.2），通过薄层展开一次难以预测柱层析的分离结果，这时可以取出薄层板，挥发除去展开剂，再置于相同或不同溶剂中展开。

双向展开：如图2-39所示，将样品点在正方形薄层板的一角，先用一种展开剂展开后，将板取出，待展开剂挥发后，把板旋转90°，再用与第一次相同或不同的展开剂展开，这祥可以得到进一步分离。

（4）显色：展开后若样品组分本身有颜色，可直接确定斑点的位置。若本身无色，则需采用其他方法使展开后样品组分显色。对于荧光物质，可在紫外灯下观察其荧光斑点；对于非荧光物质，可用荧光硅胶制成的薄板展开，而后在紫外光照射下，绿色荧光背景下将呈现暗色斑点。有些物质在绿色背景下仍无斑点显出，这时就须使用其他显色剂使分离后物质显色。实验室常用的显色剂见表2-4所示。