第三节
紫外-可见分光光度计

紫外-可见分光光度法是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的选择性吸收作用，对物质进行定性、定量及结构分析的一种光学分析方法。物质对光的吸收遵循朗伯-比耳定律：当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度（ A ）与溶液组成标度（ c ，摩尔浓度或 ρ ，质量浓度）和液层厚度（ b ）的乘积成正比。其数学表达式为

A ＝ εbc 或 A ＝ abρ

式中 ε 或 a 为吸光系数，在特定波长和溶剂一定的情况下，是吸光质点（分子或离子）的特性常数。

由于吸光物质对单色光具有选择性的吸收，在测量时应选择具有最大吸收波长（ λ max ）的光为入射光，以提高测量的灵敏度。通过作吸收曲线的方法可找出最大吸收波长。方法是在一定波长范围内，将不同波长的光分别通过一定组成标度的溶液，记录其在每一个波长下对应的吸光度 A 。然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制 A-λ 曲线，即吸收曲线。曲线上峰值对应的波长即为最大吸收波长 λ max 。

定量分析中，常用的测量方法有标准曲线法、标准对比法和吸光系数法等。其中标准曲线法应用较为广泛。方法是测量一系列已知准确浓度的标准溶液的吸光度，作 A-c 或 A-ρ 曲线，再测量样品的吸光度，根据该吸光度值即可从标准曲线上查得被测溶液的相应浓度。

常用的紫外-可见分光光度计有722型、722S型、WFJ7200型可见分光光度计及751-G型、UV-Vis 8500型紫外-可见分光光度计等。

一、722型分光光度计

722型分光光度计采用单光束、自准式光路，色散元件为衍射光栅。当单色光通过被测样品后照射到光电管上，如果被测的样品有吸收现象，则光能量会发生变化（减少）。此时，由于放大器和对数放大器的作用，其光能量的变化情况通过 位数字显示器反映出来，可以直接读出透光率T或吸光度 A 。能在近紫外、可见光区域对样品物质作定性和定量分析。

722型分光光度计由光源室、单色器、试样室、光电管、微电流放大器、对数放大器、数字显示器及稳压电源等部件组成。其外型图如图Ⅱ-8所示。

1. 操作步骤

（1）将灵敏度旋钮调至“1”（放大倍率最小）。

（2）开启电源，选择开关置于“T”，仪器预热20 mins。

（3）打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0％T”旋钮，使数字显示为“00.0”。

（4）将装有溶液的比色皿放置于比色架中，旋动仪器波长手轮，把测试所需的波长调节至刻度线处。

（5）盖上试样室盖，将盛有参比溶液比色皿置于光路，调节透光率“100％T”旋钮，使数字显示为100.0（如果显示不到100.0，则可适当增加灵敏度的档数，同时应重复操作（3），调整仪器的“00.0”）。

（6）透光率 T 的测量：将被测溶液置于光路中，由数字表上直接读出被测溶液的透光率（T）值。

（7）吸光度 A 的测量：参照操作（3）、（5）调整仪器的“00.0”和“100.0”，将选择开关置于A，旋动吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”，然后移入待测溶液，显示值即为试样的吸光度 A 值。

（8）溶液组成标度 c 的测量：选择开关由A旋至C，将已标定浓度的溶液移入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值。再将待测溶液移入光路，即可读出相应的组成量度值。

2. 注意事项

（1）每台仪器所配套的比色皿不能与其他仪器上的比色皿单个调换。

（2）仪器数字显示器后背部带有外接插座，可输出模拟信号，插座1脚为正，2脚为负（接地线）。

（3）如果大幅度改变测试波长时，必须等候数分钟才能正常工作（因波长由长波向短波或短波向长波移动时，光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间）。

二、722S型分光光度计

722S型分光光度计是一种简单易用的分光光度计。它采用非球面光源光路，CT光栅单色器和4位LED显示，具有自动调零、自动调100％T、浓度因子设定以及浓度直读功能。还附有RS-232C串行接口，便于数据输出和处理。它的测试波长范围在340 nm～1 000 nm范围内，被广泛应用于医学卫生、临床检验、生物化学、石油化工、环保监测和质量控制等领域。仪器外形如图Ⅱ-9所示。

操作步骤：

（1）测定波长的调整与预热：使用波长调节旋钮，调整测定波长，具体波长由旋钮左侧的显示窗显示，观察波长时目光应垂直于显示窗。接通电源，打开仪器电源开关，预热30 mins。

（2）调零：按 模式 键，置标尺于透射比，打开样品室盖（关闭光门）或用不透光材料在样品室中遮断光路，然后按 0％T 键，仪器能自动调零。

（3）100％T的调整：将样品和空白溶液放入样品室，置空白溶液于光路中，盖上样品室盖（同时打开光路），按 100％T 键，仪器自动调整100％T。调整100％T时，仪器自动增益重调可能影响0％T，因此调整后应检查0％T。反复调整100％T及0％T，直至稳定。

（4）样品透光率测定：将样品置于光路中，等显示窗数据稳定后，读取数据。

（5）样品吸光度的测定：按 模式 键，置标尺于吸光度，将样品置于光路中，等显示窗数据稳定后，读取数据。

（6）样品浓度直读功能：先测出标准溶液的吸光度，按 模式 键，置标尺于浓度直读，按 ↑ 或 ↓ 键，使读数为标准溶液的浓度值，将样品置于光路中，读数显示值即为样品浓度。

（7）仪器使用完毕后，关闭总开关，拔下电源插头，洗净比色皿并放回盒内避免拉乱，盖好仪器。

本仪器备有减少杂光的滤光片，以提高340 nm～380 nm波长的测定准确性。滤光片位于样品室内左侧，用一拉杆来改变位置。

三、WFJ7200型可见分光光度计

WFJ7200型可见分光光度计（图Ⅱ-10）采用低杂散光，高分辨率的单光束光路结构单色器，仪器具有良好的稳定性、重现性和精确的测量读数。5nm光谱带宽可满足绝大多数分析测试的要求。

1. 仪器操作程序

（1）基本操作

①开机前打开样品室盖，检查样品室内是否有物品挡在光路上。光路上有阻挡物将影响仪器的自检，甚至造成仪器故障。

②接通仪器电源，使仪器预热20分钟（不包括仪器自检时间）。

③用波长选择旋钮设置测试所需的波长（325nm～1 000nm）。

④用“Mode”键选择“T”测试方式，将黑体置于光路，按“％T”键，此时显示器显示“000.0”（此步骤可省略）。

⑤比色皿的配对测试：在多个相同型号的洁净的比色皿中加入纯水，将比色皿置于吸收池架中，依次将各比色皿推或拉入光路中，在其中选择“ T ”值或“ A ”值相等或相近的几个比色皿以待测试时使用。

（2）吸光度值或透光度值测试方式

①进行“基本操作”中的5项操作步骤。

②用“Mode”键选择合适的测试方式。

③调零（每变换一次波长都要重新进行调零），将参比溶液与待测溶液分别倒入比色皿中，把盛有溶液的比色皿放入吸收池架中，盖上样品室盖。将参比溶液拉入光路中，按“OA／100％T”键调OA／100％T，此时显示器显示“BLA”直至显示“100.0％” T （T方式）或“0.000” A （A方式）为止。

④调零后，将待测样品推（拉）入光路，这时显示器上显示的值即为待测样品的 T 值或 A 值。

⑤测试完毕关机，切断电源，将比色皿取出洗净，比色皿座架及暗箱用软纸擦净。

（3）样品浓度的测量方法（已知标准样品浓度值的测量方式）

①进行“基本操作”中的5项操作步骤。

②用“Mode”键将测试方式设置至A（Absorbance）状态。

③调零。

④用“Mode”键将测试方式设置至C（Concentration）状态。

⑤将标准样品推（拉）入光路中。

⑥按“Inc”或“Dec”键将已知的标准样品浓度值输入仪器，当显示器显示样品浓度值时，按“Ent”键确认。浓度值只能输入整数，设定范围为0～1999。

⑦将待测样品依次推（拉）入光路中，此时，显示器上显示出被测样品的浓度值。

⑧测试完毕关机，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。

（4）已知标准样品浓度斜率（ F 值）的测量方式

①进行“基本操作”中的5项操作步骤。

②用“Mode”键将测试方式设置至A状态。

③调零。

④用“Mode”键将测试方式设置至F（Factor）状态。

⑤按“Inc”或“Dec”键输入已知的标准样品的斜率值，当显示器显示样品浓度斜率值时，按“Ent”键确认。此时，测试方式指示灯自动指向“C”，斜率值只能输入整数。

⑥将待测样品依次推（拉）入光路中，此时，显示器上显示的数据即为被测样品的浓度值。

⑦测试完毕关机，切断电源，将比色皿取出洗净，比色皿座架及暗箱用软纸擦净。

2. 注意事项

（1）必须在开机前检查光路的通畅情况。

（2）为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。

（3）比色皿的使用方法：

①拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。

②清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗液（1∶2）浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。每次做完实验时，应立即洗净比色皿。

③比色皿外壁的水用镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。

④测定有色溶液吸光度时，要用有色溶液润洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。

⑤在实际分析工作中，通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7之间。

四、751-G型可见-紫外分光光度计

751-G型分光光度计是属于一种能测定各种物质从紫外至近红外区的吸收光谱的分光光度计。波长范围为200 nm～1 000 nm。主要组成部件有光源、单色光器、吸收池、检测器及指示器。

由光源发射出来的连续辐射光，经过单色器后成为一定波长的单色光。从出光狭缝射出的单色光，通过标准溶液，再照射到光电管上，将读数电位计标尺上的指示值调整至100％处，此时可以通过改变狭缝宽度或测量系统的灵敏度使电表指示在零位，然后移动样品槽，使同一单色光通过待测样品后，照射到光电管上。如果待测样品有吸收现象，则光强度就会发生变化（减小）。此时可以转动读数电位计来改变补偿电压，使零位计（又叫指零电表）指针重新指零，而读数电位计上的指示值就反映出样品的透射率。

它与可见分光光度计的主要不同之处是：

（1）除配有钨灯外，还配有氢灯，氢灯是常用的紫外光源。

（2）由于玻璃能吸收紫外光，石英不吸收紫外光，故用石英棱镜作为色散元件。

（3）配有玻璃和石英两种吸收池（比色皿），在紫外区使用石英吸收池。

751-G型分光光度计仪器图见图Ⅱ-11。

仪器操作步骤如下：

（1）接通电源前，应将暗电流闸门开关处于“关”的位置。

（2）开启放大器、钨灯电源开关、氢灯电源开关（200 nm～320 nm用氢灯，320 nm～1 000 nm用钨灯）。

（3）将选择开关置“校正”位置，预热20 mins，确保仪器稳定工作。

（4）将波长选择旋钮调到所需的波长。

（5）选择适应波长的光电管，手柄推入为紫敏光电管（200 nm～625 nm）；手柄拉出为红敏光电管（625 nm～1 000 nm）。根据需要可以将相应的滤光片推入光路，以减少杂散光（通常情况可以不用）。

（6）根据波长选配比色皿，波长＞350 nm用玻璃比色皿；波长＜350 nm用石英比色皿。

（7）调节灵敏度旋钮，自左面起点位置顺时针转5圈左右。

（8）调节暗电流调节钮，使电表指针准确指“0”（为了得到较高的准确度，须每次校正暗电流）。

（9）将读数电位计旋钮转至透光率100％。

（10）移动吸收池拉杆，将空白溶液置于光路中。

（11）把选择开关置于“×1”的位置。

（12）拉开暗电流闸门，使单色光进入光电管。调节狭缝宽度旋钮，使电表指针大约指“0”，然后再用灵敏度旋钮仔细调节，使指针准确指在“0”位上。

（13）移动吸收池拉杆，使待测溶液置于光路，此时电表指针偏离“0”位。旋转读数电位计刻度盘，重新使电表准确指“0”。

（14）关闭暗电流闸门以保护光电管。

（15）读取吸光度或透光率并记录之。

当透光率范围在10％～100％时，选择开关放在“×1”档；当透光率＜10％时，则选择开关应放在“×0.1”档，此时所读透光率应乘以0.1（吸光度读数应加上1.0），得到测量值。

（16）调换待测溶液（或更换波长）测定时，需重复操作（8）～（15）步骤。

（17）测定结束时：

①选择开关、放大器开关置“关”的位置，关闭电源，拔去插座。

②置狭缝钮于0.1 nm，波长放在625 nm，透光率放在100％。

③比色皿用乙醚、酒精、蒸馏水依次清洗，最后用擦镜纸擦干并放入盒内。

五、UV-Vis 8500型紫外-可见分光光度计简介

UV-Vis 8500型紫外-可见分光光度计是一种新型的双光束紫外-可见分光光度计。能进行波长扫描定性分析，多阶导数测量，单、双、三波长定量分析；多波长测定；化学动力学测定，曲线的组合及运算，图谱多阶微分平滑，图谱缩放；峰值标定、筛选及搜索；回归曲线多阶拟合等等。仪器配有微机处理系统，操作界面上设有快速按钮，各种工作状态一目了然，中英文提示各操作功能。故操作方法简单，只需按照电脑提示操作，即可快速测出结果。 KC9wvr6mRvfQXa1P7rif3rbhvTcirqyEhS0BTtwktSJW7FvGlplWyBFnEu2irTco