下载掌阅APP，畅读海量书库
立即打开
大鼠卵细胞的体外受精
宫本，张明觉
编者按
美籍华裔科学家张明觉最广为人知的工作是开发了口服避孕药，本文中他以大量的动物体外受精实验阐明了大鼠卵细胞的体外受精过程。在很多其他物种中，哺乳动物的卵细胞成功的体外受精已得到阐明。先前张明觉已经亲自完成了兔子的体外受精，他在实验室中将已受孕的黑兔的胚胎移植到一只白兔体内。关键问题是张明觉认识到射精后精子成熟或者称为“精子获能”的重要性，精子获能这种现象是他独立发现的，同时生殖生物学家科林·罗素·奥斯汀也独立发现了相同的现象。张明觉的研究为人类卵细胞的体外受精奠定了基础，最终在1978年诞生了世界上第一个“试管婴儿”路易丝·布朗。 英文
奥斯汀 [1] 和张明觉 [2] 发现“精子获能”后，科学家已经在很多物种中实现了哺乳动物的体外受精 [3-17] 。尽管也有人尝试大鼠卵细胞的体外受精 [1,18-20] ，但只有在透明带被胰凝乳蛋白酶溶解后，才能观察到精子进入卵黄。我们在本文中报道了完整的大鼠卵细胞的体外受精及获得的结果。 英文
成熟的CD系雌性大鼠饲养在具有人工照明（19:00~7:00黑暗）且保持恒定室温（23~25℃）的恒温室中，并且每日进行阴道涂片检查。从发情前期过渡到发情期的夜晚，排卵通常发生在2:00左右 [21] ，因此发情前期的大鼠分别于次日6:00~7:00和9:30~10:30被处死时，卵细胞被视为处于排卵后大约4~5 h和7.5~8.5 h。通过在发情期早上腹腔注射30国际单位的孕马血清（PMS）并在52~58 h后注射30国际单位的人绒毛膜促性腺激素（HCG），实现成熟大鼠超排卵；注射HCG14~16 h后处死大鼠。在表面皿上盛放少量盐水并用轻质石蜡油覆盖，在含5%CO 2 的空气中于37℃进行平衡，再将输卵管置于轻质石蜡油下，然后通过切开输卵管壶腹部释放卵丘细胞块内的卵子。准备好授精用的精子。以图1中的方式用准备好的精子对卵子授精。 英文
培养8~12 h后，移出卵细胞，将其封装于一个载玻片并进行镜检。然后用中性福尔马林固定并染色，以评估受精状况。在卵周隙空间内存在精子（额外精子）的卵细胞被定义为“被穿透的”卵细胞。若在这些卵细胞的卵黄中或卵黄上，要么有膨大的精子头部，要么存在带有受精精子尾部的雄性原核，便可将其视为正在受精。 英文
图1. 一个在体外受精过程中处在原核阶段的大鼠卵细胞，图中显示雄性原核（M），雌性原核（F），受精精子的尾部（箭头）和一个附着在透明带上的精子（S）。样品固定前在相差显微镜下照相。用于授精的精子来源于附睾尾部或已经交配的0.5~1 h或10~11 h的雌性大鼠子宫。向表面皿上滴加一滴浓稠的精液，其上再覆盖3 ml培养基（该培养基是改良Krebs-Ringer 碳酸氢钠溶液，含有114.2 mM NaCl，4.78 mM KCl，1.71 mM CaCl 2 ·2 H 2 O，1.19 mM KH 2 PO 4 ，1.19 mM MgSO 4 ·7 H 2 O，25.07 mM NaHCO 3 ，0.55 mM丙酮酸钠，21.58 mM乳酸钠和5.55 mM葡萄糖，并加入4 mg·ml –1 结晶牛血清白蛋白，50 μg·ml –1 硫酸链霉素和75 mg·ml –1 青霉素G（钾盐））。用1 M NaOH将培养基pH值调至7.4~7.5并将终溶液用微孔过滤器过滤以保证无菌。心脏穿刺收集雌性大鼠血液，凝固后离心分离。血清通过微孔过滤器过滤除菌后储存于石蜡油下，在2~5℃保存不超过5天。用注射器针头从发情期雌性大鼠体内收集子宫液。去除输卵管及其碎片后，在石蜡油下，向卵细胞团块加入0.4 ml精子悬浮液进行授精。某些情况下，卵细胞团块用相同培养基清洗3次以除去输卵管液。加入0.1或0.2 ml温育处理（56℃，40 min）的大鼠血清后，卵细胞和精子充分混合，并在含5% CO 2 的空气环境中37℃培养。悬浊液中精子的终浓度为每毫升1,000~4,000个精子。
图1显示了一个处于原核阶段的大鼠卵细胞体外受精的情况。表1显示从自然排卵的大鼠体内收集到的卵细胞比那些从超排卵大鼠体内收集到的卵细胞有更多机会（ P <0.01）发生体外受精（最高穿透率为45%比22%）。从子宫中分别收集大鼠交配后0.5~1 h和10~11 h的精子，对卵细胞授精并计算穿透率。无论自然排卵还是超排卵的卵细胞，用10~11 h精子授精的卵细胞穿透率（17%~45%）高于（ P <0.05）用0.5~1 h精子授精的卵细胞穿透率（7%）。排卵后4~5 h收集的卵细胞显示其被穿透的可能性（24%~45%）比排卵后7.5~8.5 h收集的卵细胞（1%~5%）要高。授精前清洗卵细胞团块，则正常排卵（45%比24%）和超排卵（17%~22%比9%~11%，无显著性差异）的卵细胞穿透率均下降，说明某些有益的因子可能被冲洗掉了。尽管不同比例的大鼠血清加入培养基后并未观察到明显差异，但在一些实验中，培养基内加入大鼠全血清后未观察到精子的穿透。然而，当使用在含大鼠血清和子宫液的培养基中预先培养了2~7 h的附睾精子时，在52个自然排卵的卵细胞和229个超排卵的卵细胞中，均未观察到精子的穿透，它们比子宫培养的精子保持更长时间的活力。这种情况以及交配后10~11 h从子宫回收的精子，其穿透卵细胞的比例较高的事实明确说明大鼠精子在能够穿透卵细胞之前的确需要在雌性生殖道中获能。仓鼠 [6,8] ，小鼠 [15] ，豚鼠 [17] ，可能还包括人 [9,10] 的精子能够体外获能，但是我们已经看到了大鼠精子体外获能是很困难的。在这方面大鼠和兔的精子是类似的。 英文
表1. 大鼠卵细胞的体外受精
* 授精前清洗3次卵细胞团块。
† 授精前附睾精子在子宫液存在的情况下孵育2~7 h。
在126个经历受精的卵细胞中，114个（90%）是单精受精的，而12个（10%）是多精受精的；12个有膨大的精子头部，而114个有至少一个雄性原核。50个单精受精卵细胞和12个多精受精卵细胞有1~26个额外精子。在88个未受精的卵细胞中也发现了额外精子（1~11个），这提示由于卵细胞在体外变质，导致卵黄阻断精子的穿透。大鼠卵细胞体内受精时多精受精的发生率约为1.2% [22] 。而相比之下，仓鼠 [6] 和小鼠 [15] 卵细胞体外多精受精发生率要高。尽管最近布雷古拉报道了大鼠卵细胞体外受精 [20] ，但其使用的方法、发表的照片以及体内未受精的大鼠卵细胞高频率的卵裂 [23] ，使得他的论断没有说服力。 英文
本研究得到了美国公共卫生署和福特基金会的资助。我们感谢罗丝·巴特克女士的帮助。 英文
（吴彦 翻译；曹文广 审稿）