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壁画《最后的晚餐》
1495年，达·芬奇开始创作举世闻名的壁画《最后的晚餐》，此画是他这一时期最负盛名的作品，被称为“人类绘画的极品”。这幅画被直接画在修道院的餐厅墙上，长910厘米，宽420厘米，取材于《圣经》新约全书马太福音第26章犹大出卖耶稣的传说，表现了基督耶稣被捕前和门徒最后会餐诀别的场面。
达·芬奇最伟大的作品《最后的晚餐》
相传，耶稣曾在耶路撒冷的神殿上猛烈抨击伪善的人们，说他们是毒蛇的子孙。因此遭到他的宗教敌人的仇恨，他们欲将其置于死地。耶稣的门徒犹大因为惧怕黑暗势力而背叛了耶稣，他接受了祭司长30枚银币并答应做内应帮他们逮捕耶稣。逾越节的前夜，耶稣和他的十二名门徒坐在餐桌旁，共进庆祝逾越节的晚餐，这是他们在一起吃的最后一顿晚餐。在餐桌上，耶稣突然非常苦恼地告诉他的门徒们，他们其中的一个将出卖他；但耶稣并没说出他是谁，众门徒也不知道谁将会出卖耶稣。犹大被耶稣揭露了叛变行为，便提前离席去给敌人通风报信，带领敌人前来捉拿耶稣。
达·芬奇紧紧抓住最重要的情节，来表现戏剧性的冲突。当耶稣突然向门徒宣布，“我实实在在地告诉你们，你们当中的一个人要出卖我”，正是这一瞬间，门徒们受他们内心感情的驱使，呈现出各种姿态和表情。
画中耶稣坐在餐桌的中央。十二个门徒分四组沿餐桌而坐。耶稣知道门徒中有人出卖了他，摊开的双手显示了他的悲伤，但他仍是平静的。我们可以看到他明晰的轮廓衬托在背景墙的窗子上，透过窗子，湛蓝的天空犹如一只光轮环绕在耶稣的头上。在耶稣右边的一组人中，我们看到一个黑暗的面容，他的肘部搁在餐桌上，手里抓着一只钱袋，整个身体都仿佛往后退缩似的。他就是那个叛徒——犹大。他手中抓着的钱袋正是他本人的象征：他是为耶稣和其他门徒保管钱财的人。通过达·芬奇的绘画方式，我们不难辨别出这个罪恶的叛徒犹大。犹大的侧面阴影旁是圣·彼得，他有银色的头发和一双白晳的手，彼得的右手握着一把刀，刀尖对着犹大的背后，偶然间透着某种暗示。在所有门徒中，圣·约翰是耶稣最喜爱的一个。他和耶稣一样平静，显然已经领悟了耶稣的话。耶稣左边是小雅各，他摊开两手大声惊叫。从小雅各的肩上望去，是圣·托马斯，他疑惑不解的神色通过他竖起的手指表现出来。小雅各的另一边，圣·菲利普正往耶稣靠去，双手放在胸前似乎在说：“你知道我的心，我是永远不会出卖你的。”他由于爱和忠诚而显出苦恼的神情。
围着耶稣的这六个门徒，是画面所要表现的中心。侧面的巴塞洛缪与老雅各的身体向他们倾着，而他们身旁的老安德鲁并没有站起来，但他想听听，于是便举起手似乎在要求大家安静。右边还剩下其他三个门徒，他们正在讨论耶稣说的那句话，他们的手指向餐桌的中央。所有的这一切都发生在这幅伟大的作品之中，每当我们欣赏它时，都会从门徒的动作和表情中获得新的含义。
《最后的晚餐》就在这个教堂里
这本来是一个多世纪以来的传统题材，但只有达·芬奇的《最后的晚餐》达到了最高的成就。巧妙的构图和独具匠心的经营布局，使画面上的厅堂与生活中的饭厅建筑结构紧密联结在一起，使观者感觉情景似乎就发生在眼前。在人物布局上一反平列于饭桌的形式，将基督独立于画面中央，其他门徒通过各自不同的手势、表情，分别表现出惊恐、愤怒、怀疑、表白和慌张的情绪。这种典型性格的描绘，突出了绘画的主题，与构图的统一效果互为补充，堪称美术史上最完美的典范之作。
达·芬奇从1495年开始着手创作《最后的晚餐》。为了更好地把握人体，达·芬奇不顾教会的禁令，解剖尸体30多具，并深入生活，对各种类型的人进行长期细致的观察，琢磨他们的动作和神态。
《最后的晚餐》的创作时间集中在1495年至1498年间，在那段时间里，达·芬奇把全部的时间和心思都放在了绘画上，像疯了一样。与他同时代的意大利作家玛蒂奥·班杰洛曾与达·芬奇相处过一段时间，他在自己的回忆录中写道：“从太阳升起直到夜幕降临，达·芬奇的画笔从不离手，常常达到废寝忘食的地步。有时，在正午时分，骄阳似火，我也会看到他从韦西亚议会大厦出来，直奔修道院，爬上脚手架，给某个部位添上几笔。”
犹大之吻
达·芬奇的这种作画方式令有些人很不能理解。修道院的副院长以为作画就和在菜园干活儿一样，不能停歇。他一看到达·芬奇沉思默想，就以为他是在拖拉工作，心里十分不满，便跑去向公爵告状。公爵找来达·芬奇问话，达·芬奇回答说：“有天资的人，当他们工作最少的时候，实际上工作得最多。因为他们在构思，把想法酝酿成熟，然后很快地付诸实践。”他还说，这幅画还有耶稣和犹大两个人的头像没有画好，人间很难找到具有耶稣那样神圣仪容的人做模特；而犹大的头像更叫人伤脑筋，他不知道该如何表现这个叛徒的嘴脸。如果催得太急的话，他只有按照副院长的尊容画了。公爵听后哈哈大笑，从此副院长再也没有告过他的状。