1.脑脊液常规
脑脊液常规检查对本病无确诊价值,一部分患者单核细胞数增多,大部分患者蛋白增加,糖含量可降低。
2.血常规
本病患者白细胞数和血红蛋白降低。
3.HIV抗体
(1)检测方法:HIV抗体的检测分为筛查试验和确认试验,筛查试验有ELISA法、明胶颗粒凝集试验(PA)、斑点ELISA(dot-EIA)、斑点免疫胶体金(或胶体硒)快速试验、目前常用的是ELISA法;确认试验包括免疫印迹试验(WB)、条带免疫试验(LIATEK HIV-Ⅲ)、放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)。国内常用的确认试验方法是WB。
1)ELISA法:目前国内外主要使用第三代ELISA(双抗原夹心法)试剂。第四代ELISA试剂是最近发展起来的HIV抗原抗体联合检测试剂,可同时检测P24抗原和抗HIV-1/2抗体。与第三代抗HIV-1/2试剂相比,检出时间提前了4~9天。
2)明胶颗粒凝集试验(PA):待检样品含有的HIV抗体与抗原致敏的明胶颗粒发生抗原-抗体反应,根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA试剂有两种:①HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂(AFD HIV-1/2 PA):已经经过我国食品药品监督管理局(SFDA)注册批准;②HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂(SERODIA-HIV-1/2):可初步区分HIV-1型和HIV-2型,目前我国尚未引进。
3)斑点ELISA法(dot-EISA):将HIV抗原在硝酸纤维膜上滴成点状,作为固相抗原,待检样品含有的HIV抗体与之反应。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10分钟以内,使用抗原量少。
4)斑点免疫胶体金(或胶体硒)快速试验:与斑点EIA相似,区别在于以红色的胶体金(或胶体硒)A蛋白作为标记物,用渗滤法作为洗涤方法。试剂稳定,可室温长期保存。试验时不需任何设备,迅速、简便、特异性较好,敏感性约相当于中度敏感的ELISA,适用于应急检测、门诊急诊个体检测。目前已有在国内被SFDA批准注册的国外进口试剂和国内产品。一般可在10~30分钟内判读结果。
5)艾滋病唾液检测卡:在硝酸纤维膜上包被人工合成的HIV gp41/gp36蛋白抗原,可同时检测含在唾液中的HIV-1/ HIV-2抗体。主要检测唾液中的HIV IgA与IgG抗体,敏感性特异性与ELISA相近,可避免静脉穿刺。但样品预处理时间长且售价较高。
6)确认试验的检测流程:有HIV-1/2混合型和单一的HIV-1或HIV-2型。先用HIV-1/2混合型试剂进行检测,如果呈阴性反应,则报告HIV抗体阴性;如果呈阳性反应,则报告HIV-1抗体阳性;如果不满足阳性标准,则判为HIV抗体检测结果不确定。如果出现HIV-2型的特异性指示条带,需用HIV-2型免疫印迹试剂再做HIV-2的抗体确认试验,呈阴性反应,报告HIV-2抗体阴性;呈阳性反应,则报告HIV-2抗体血清学阳性,并将样品送国家参比实验室进行核酸序列分析。
(2)标本:血清、血浆、脑脊液。
(3)参考范围:正常人HIV抗体阴性。
(4)临床诊断价值和评价:检测HIV抗体是常规使用的HIV病原学诊断的方法。检测出HIV抗体的时间取决于HIV感染者的反应性和HIV病毒的特性。在感染HIV-1后,患者血清中最先出现p24抗原,然后各种HIV-1抗原可达到高峰;2~6周后,随着HIV-1抗体产生及浓度的不断增加,HIV-1抗原渐趋降低或检测不出。从受艾滋病病毒感染到血液中可以测出艾滋病病毒的抗体,这段时间称为“窗口期”。“窗口期”短的为2~3周,长的可以为2~3个月,在“窗口期”内HIV抗体检测呈阴性,应用其他方法如p24抗原检测以辅助诊断。HIV抗体初筛结果阴性者或可疑者,半年后可进行第二次检测,但不需要多次检测。HIV抗体初筛结果阳性者,须进一步做确证试验。确证试验报告HIV抗体可疑的患者,应在3个月后进行复查。
(5)方法学评价和问题
1)不同个体对不同抗原成分的反应性均有所不同,相应抗体的产生时间和不同个体对相同抗原成分的免疫应答强度等存在一定差别,检测方法和使用试剂的敏感性不同对HIV-1抗体的检出时间也有影响。
2)筛查试验阳性不能出阳性报告。对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应,则报告HIV抗体阴性;如均呈阳性反应,或一阴一阳,需送艾滋病确认实验室进行确认。
3)用于抗体检测的血清或血浆样品,应存放于-20℃以下,短期(1周)内进行检测的样品可存放于2~8℃。
4)严格遵守实验室标准操作程序(SOP),严格按照试剂盒说明书操作,注意防止样品间交叉污染,同时注意实验室安全防护。
5)筛查试验和确认试验的试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、每批检验合格、在有效期内的试剂。
4.HIV-1 p24抗原
(1)检测方法:p24抗原的检测通常是采用ELISA夹心法,为了提高检测血清中p24抗原的敏感性,需先将血清中免疫复合物解离后再进行检测,目前已发展了ICD p24抗原(免疫复合物解离,immun-complex disassociate,ICD)检测试剂,用于HIV-1 p24抗原检测。即使将复合物解离,敏感性提高,也只能在大约50%无症状感染者中检出p24抗原。
(2)标本:血清、脑脊液。
(3)参考范围:正常人HIV-1 p24抗原呈阴性。
(4)临床诊断价值和评价:HIV-1 p24抗原检测用于以下几种情况:HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断,阳性仅作为辅助诊断依据,不能据此确诊;HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断;第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应,但HIV-1抗体确认阴性者的辅助诊断;监测病程进展和抗病毒治疗效果。
(5)方法学评价和问题
1)HIV-1 p24抗原的阳性结果必须经过中和试验确认,若阳性标本的OD值比中和反应前减少50%以上,才确定为HIV p24抗原结果阳性。
2)HIV-1 p24抗原检测的敏感性为30%~90%,低于病毒载量检测。HIV-1 p24抗原阴性结果只表示在本试验中无反应,不能排除HIV感染。
3)婴幼儿经过胎盘或哺乳从母亲获得的HIV抗体不能用于诊断是否经母婴传播感染HIV。婴幼儿体内从母亲得到的HIV抗体持续存在时间最长不超过18个月。在18月龄以前可以用多种不同的非抗体依赖性的检验方法对新生儿HIV感染进行辅助诊断,包括:HIV p24抗原检测、病毒分离培养、RNA或DNA检测。
5.CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞
(1)检测方法:流式细胞仪检测。
(2)标本:用EDTA-K 2 抗凝血。
(3)参考范围:正常人CD4 + /CD8 + 比值为1~2。
(4)临床诊断价值和评价
1)了解机体的免疫状态以进行疾病分期,如美国CDC就是以此为基础制订了HIV感染者/AIDS患者的诊断和分类标准(表2-1)。
表2-1 HIV感染的分类系统和青少年及成人扩展的AIDS监测病例定义
备注:A、B、C的解释请参考《艾滋病病毒感染的诊断与治疗》,邵一鸣、蒋岩、栾文民,科学出版社,2002年
2)长期监测CD4 + T淋巴细胞绝对数的变化,有助于了解患者的病情发展,决定正确的治疗方案,并观察对治疗的反应。如判断HIV感染者的临床并发症,当CD4 + T淋巴细胞<200/μl时,很容易发生卡氏肺孢子虫肺炎;当CD4 + T淋巴细胞<50/μl时,易发生巨细胞病毒感染。
3)帮助确定抗HIV药物治疗及预防机会性感染治疗的适应证,如当CD4 + T淋巴细胞<200/μl时,应给予抗卡氏肺孢子虫肺炎的预防性治疗。
4)是评价一些新的、针对HIV的治疗方法和治疗药物疗效的重要指标。
(5)方法学评价和问题:如果样品较热或较冷,但没有明显的溶血或结冰,可以处理样品,但要在工作表的报告上注明温度条件。不要马上加热和冷冻样品以使其达到室温,因为这样会对免疫表型检测的结果产生不利的影响,散射光模式的不正常会显示出所受到的影响。不可检测溶血或结冰的样品。不可检测凝血的样品。用于CD4 + /CD8 + T淋巴细胞检测的样品不能长期保存,样品采集时间超过48小时则不可检测。
1.HIV核酸定性
(1)检测方法:检测血浆或血清样品使用RT-PCR方法,检测血细胞样品一般使用套式PCR方法扩增两轮。
(2)标本:血浆、血清或血细胞,脑脊液。
(3)参考范围:正常人HIV核酸定性检测呈阴性。
(4)临床诊断价值、方法学评价、问题
1)HIV核酸定性检测可用于HIV感染的辅助诊断,如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效检测、预测疾病进程等,可用于特殊情况下的早期HIV感染、判断婴儿HIV感染以及血清学不确定结果的验证和补充,不单独用于HIV感染的诊断,不是HIV感染的常规诊断方法。
2)中国CDC推荐的样品处理和试剂准备程序是:①实验前将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面,2分钟后用纸巾擦除;②移入盛放污染材料的器皿、所需的试剂、耗材和样品,进行试验;③一个实验区域在同一时间段只进行一种实验;④实验结束后移出个人专用材料至个人专用区域,封好污染材料盛放器皿并移至污物袋,移出共享器具至专门区域保管,将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面,2分钟后用纸巾擦除,打开紫外线灯照射至少15分钟。
3)以检测为目的一般使用HIV gag 和(或) pol 和(或) env 和(或)其他基因区的引物、进行HIV-1的基因亚型检测常使用 HIV-1 gag 和(或) pol 和(或) env 基因区的引物。在进行RNA反转录时可使用扩增的下游特异性引物或随机引物,可参考文献的引物序列或自行设计引物,应尽量涵盖常见的HIV毒株,也可使用复合引物。所有的标本都应做双份平行检测,阳性结果还要扩增另外一个基因区的一对引物进行进一步检测。每一次检测都至少同时做两个阳性对照和两个阴性对照,只有在阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增片段、双份平行标本结果一致的情况下,实验结果才可信。标本的任何两个基因区(env和gag,或env和pol,或gag和pol或其他两种基因组合)呈阳性才能判定为阳性结果。
2.HIV核酸定量(病毒载量)
(1)检测方法:常用的HIV RNA定量检测方法有反转录PCR试验(RT-PCR)、核酸序列扩增试验(NASBA)、分支DNA杂交试验(bDNA)。
(2)标本:EDTA-K 2 抗凝血。
(3)参考范围:建议参照国家参比实验室的范围。
(4)临床诊断价值、方法学评价、问题
1)辅助诊断:在某些情况下,单纯抗体检测不足以作出明确的判定,如出现某些非典型的抗体反应形式,特别是不确定反应时,RNA的检测可提供非常有用的证据。单纯使用RNA检测不能完全确定感染与否,但当RNA检测出现较高拷贝数的阳性结果时(>3000c/ml),发生HIV感染的可能性非常大。
2)早期诊断:HIV感染早期,在抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰,此高峰通常高于发病时的血浆病毒水平,这个时期的病毒具有很高的感染能力。此高峰在免疫系统产生反应后,尤其是在细胞免疫出现后开始下降。在HIV感染的“窗口期”无法使用抗体检测进行诊断,因此早期病毒RNA检测具有特殊的意义。该法也可用于HIV感染孕妇所生婴儿的早期辅助诊断。
3)病程监控:HIV感染发生后病毒载量变化与疾病的进程有着密切的相关性,定期检测病毒载量有助于确定疾病发展的阶段,以确定相应的治疗方案。
通常在HIV感染后无症状期内发生的感染或其他临床症状很难与AIDS发病时的症状区别,为确定一个刚发生的症状是否与HIV的感染有关,医生往往需要观察患者的实验室指标,病毒载量就是一个非常重要的指标。
4)指导治疗方案及疗效判定:由于经济上的原因以及抗病毒药物的副作用和疗效原因,并非在任何情况下HIV感染者都应该进行抗病毒治疗,通常在病毒载量达到一定水平后(如>35 000~50 000c/ml)抗病毒治疗才具有良好的效果。在进行治疗后,通过病毒水平的检测才能确定治疗是否有效,通常在治疗前后病毒水平降低0.5log以上才被认为临床有效。
5)预测疾病进程:观察HIV感染者病毒RNA水平可大致预测其发病的可能。病毒载量与6年发病率的关系为:<500c/ml时5.4%;501~3000c/ml时16.6%;3001~10 000c/ml时31.7%;10 001~30 000c/ml时55.2%;>30 000c/ml时则为80%。当HIV感染者CD4 + T细胞计数<200/μl时,病毒载量与3~6个月发展至AIDS的危险为:<10 000c/ml为4.9%;10 000~29999c/ml为12.7%; 30 000~99 990c/ml为17.7%;>100 000c/ml为22.4%。在CD4 + 细胞数相同的情况下,年龄大的患者比年龄小的患者发展至AIDS的危险更大。
6)方法学评价和问题:核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20℃以下,进行病毒RNA检测的样品如需保存3个月以上应置于-80℃。该法只能在有条件的实验室进行检测且实验费用昂贵。
1.流行病学资料及临床表现可为诊断神经系统艾滋病提供线索,但神经系统艾滋病的确诊、病程的监控及疗效的评定有赖于实验室检查,主要包括HIV抗体、HIV抗原、HIV核酸检测以及CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞检测。
2.诊断该病的检验项目首选组合:血清HIV抗体+脑脊液HIV抗体。HIV抗体阳性者结合流行病学资料、临床表现等可作出初步诊断。
3.由于“窗口期”内HIV抗体可呈阴性,因此HIV抗体阴性不能排除该病,应进一步进行HIV-1 p24抗原检测、HIV核酸定性或HIV病毒载量检测,阳性者可作出早期辅助诊断。
4.婴幼儿体内从母亲得到的HIV抗体持续存在时间最长不超过18个月,在18月龄以前HIV抗体检测不能用于诊断是否经母婴传播感染HIV,可以用HIV-1 p24抗原检测、HIV核酸定性或HIV病毒载量检测作早期的辅助鉴别诊断。
5.病程监控、指导治疗方案及疗效检测、预测疾病进程等可进行HIV-1 p24抗原检测、CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞检测、HIV核酸定性或HIV病毒载量检测。
(李小龙 陈晓丽)