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第二节
动物实验管理技术
Section 2
Animal experiment Management Technology

动物实验管理技术(animal experiment Management Technology)覆盖了从动物进入实验室到实验结束离开实验室全过程,包括对动物来源、验收入室、实验期间饲养照料等内容,应与动物的生物学特性和实验应用密切配合,是保障实验期间动物的生活质量以及保障动物实验顺利进行必不可少的。

一、动物的来源

使用标准化的实验动物开展研究,是保障动物实验结果科学、可靠的关键。随着实验动物生产和使用的分离以及实验动物商品化供应逐渐成熟,研究者应向持有实验动物生产许可证或具有相应资质的实验动物生产供应单位购买标准化实验动物,以确保动物质量。订购动物时,应根据实验设计并结合动物生长规律进行预订,预定时须将动物的种、系、日龄、体重、性别、数量等规格写清楚。

二、动物的接收和验收

接收和验收外来动物进入实验室,是动物实验正式开始后的第一个步骤。无论是从其他设施运来的动物,还是从本设施其他饲养室转移过来的动物,都需要执行接收和验收程序,其目的是“验明正身”,包括对动物种系、数量、性别、规格(年龄/体重)、净化等级等信息的核对,并对动物的包装进行检查,确认其与动物净化等级匹配且无破损和其他可疑之处。

接收和验收必须在动物抵达后的第一时间进行,因为在将动物从一处设施转运至另一处设施时,动物暂时处于不利的生活环境中,包括运输笼箱的新异环境、断水断食、通风换气效率低等,在这样环境中所处的时间越长,动物健康所受的影响越大,对实验研究的潜在干扰也越大。由于强烈的应激效应,一些动物甚至可能在运输途中或到达实验室等待接收的期间死亡。对于需要饲养在屏障环境中的动物,应在将动物连同包装一起送入屏障设施后,才能开启包装查看动物。

对于每批购入动物,都应验看所附的质量合格证明,动物的遗传背景资料、动物微生物检查资料及动物年龄和健康等方面的资料。此外,购买犬、猴等动物时,应向售出单位索要该批动物的免疫和(或)检疫证明;购买非人灵长类动物时,还应办理相应的使用许可手续。如果从外地购买动物,应考虑运输中的各种因素对实验动物的影响,并查看运输检疫证明;从国外引进实验动物时,必须到动物进口检疫局办理相关手续,隔离检疫期较长(2个月),应充分考虑时间对动物的影响。

对动物包装的验收应注意,若是购入或领取清洁级以上的实验动物,应采用带有空气过滤膜的无菌运输罐或带过滤帽的笼、盒运输,并严格检查其密封状况。

开箱查看动物的健康状况以外观为主。主要内容包括:①皮毛:有无光泽、出血、干燥;②眼:有无眼屎、流泪、白内障、角膜损伤等;③耳:有无外伤、耳壳曲折、中耳炎等;④四肢:有无弯曲、脱臼、外伤、关节炎;⑤肛门:有无下痢、血便、脱肛等。

三、动物的检疫、观察和适应

任何来源的实验动物,在通过验收进入实验室后都不能立即开展实验研究,而必须经过一定期限的检疫或者健康观察,以及适应性饲养,这是为了消除动物的运输应激,帮助动物适应实验室环境,并且及时发现动物潜在的疾病和其他健康问题。为防范疾病的传播,检疫、观察和适应需要在专门的隔离区域内开展。

(一)清洁级及以上的动物

清洁级以上的标准化实验动物具有比较清晰的微生物背景,排除了大多数已知的对人和动物危害大的致病微生物和寄生虫,在应用前通常无需检疫,而采用3~14天的健康观察和适应性饲养,期间为动物提供和日后饲养一致或相近的环境条件与护理,观察并记录动物的恢复和适应情况,重点在于观察动物在经历运输和生活环境改变后的应激反应消除情况,这些应激可能导致动物脱水、食欲下降、性情改变等,并可能诱发潜在疾病。啮齿类动物的健康观察适应期限至少3天,可以针对应激状态适时采用各类干预措施,并根据观察结果适当延长。

(二)普通级及以下的动物

普通级动物仅排除了人畜共患病的病原和动物烈性传染病病原,非标准化的动物可能携带各种对人类和动物具有巨大危害的病原,然而有些研究必须使用这样的动物,如普通级的犬和非标准化的猕猴,为了防范疾病的传播,必须对引进的动物进行隔离检疫,同时作必要的临床检查和免疫接种。对普通级的标准化实验动物和来源于养殖场的动物,如犬、猴、猪、羊等,需要隔离检疫,了解其免疫接种的情况,并进行必要的临床检验和免疫。普通级豚鼠和兔的检疫期一般为7天,检疫的主要目的是观察有无潜在疾病的应激性暴发,以及适应性饲养。检疫期间做好各项观察记录,必要时进行兽医诊断。

普通级犬的检疫期一般为30天,本地来源、背景清楚者可缩短至7~14天,异地来源、背景清楚者可缩短至14~21天。检疫期间建立检疫档案,登记动物来源、性别、齿列、体重和特征,观察神情和食欲,有无呕吐,粪便形态,姿势和步态是否异常,眼是否红肿,角膜是否浑浊或有脓性分泌物,鼻端是否干燥,有无浆液性或脓性分泌物,口内是否流涎,是否吞咽困难,皮肤有无皮疹,痂皮和溃烂,肛门周围是否清洁,有无炎症和溃疡,雄性生殖器有无溃烂或脓性分泌,雌性阴部有无脓性分泌物或发情状态。驱除体内外寄生虫,注射狂犬疫苗、犬瘟热疫苗、犬细小病毒疫苗,或核对免疫记录,检查血清抗体滴度。

普通级猕猴的检疫期一般为60天,本地来源、背景清楚者可缩短至14天,异地来源、背景清楚者可缩短至30天。检疫期间建立检疫档案,登记动物来源、性别、齿列、体重和特征,外观检查包括体表、口唇溃疡、伤残,触诊淋巴结是否肿大,进行粪便细菌培养,实验室检查肝功能、血常规、结核菌素试验(OT皮试)、X线胸透,B病毒感染情况,并驱除体内外寄生虫。

野外捕获的动物如猴、猫等,由于无从获知其微生物学背景,应进行严格的临床检验和免疫接种,发现人畜共患病或动物传染病应立即淘汰。检疫和健康观察同时也是适应的过程,因此需要为动物提供近似于实验环境的生活环境和日常照料。

四、动物的随机分组

实验开始前,对动物进行分组应尽量保证随机性,确保每个动物有均等的机会分配于任何一个实验组,从而避免分组的人为因素干扰研究结果。

随机分组的方法很多,如抽签、拈阄等形式,但最好的方法是使用随机数字表或计算器。随机数字表上所有数字是按随机抽样原理编制的,表中任何一个数字出现在任何一个地方都是完全随机的。计算器内随机数字键所显示的随机数也是根据同样原理贮入的。

随机数字表使用简便,假设从某群体中要抽10个个体作为样本,那么,可以先闭目用铅笔在随机数字表上定一点,假定落在第16行17列的数字76上,那么可以向上(向下、向左、向右),依次找42、22、98、14、76、52、86、76,把包括76在内的这10个号的个体按号作为样本,来作为研究总体的依据。

(一)将实验动物随机分成两组

设有小鼠14只,试用随机数字表将其分成两组。先将小鼠依次编为1、2、3…14号,然后任意从随机数字表的某一行某一数字开始抄录14个数,编排如下。

动物标号:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

随机数字:16 22 77 94 39 49 54 43 54 82 17 37 93 23

归组:B B A B A A B A B B A A A A

现令单数代表A组,双数代表B组,结果列入A组的动物8只,列入B组的动物有6只,如果使两组相等,须将A组减少1只,划入B组。应把哪一只小鼠划入B组,仍可用随机数字表,在上述抄录的14个数字后面再抄录一个数字78,此数以8除之,因为归入A组的小鼠有8只,得余数6。于是把第6个A(即编写为第12号的小鼠)划入B组。经过这样的调整,两组小鼠的分配如下:

A组:3 5 6 8 11 13 14

B组:1 2 4 12 7 9 10

(二)将实验动物随机分成三组

设有动物15只,随机等分成A、B、C三组。将动物编号后,按上述方法,从随机数字表抄录15个数,将各数一律以3除之,并以余数1、2、3代表A、B、C,结果归入A组的动物6只,归入B组的动物4只,归入C组的动物5只,即:

动物编号:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

动物数目:18 62 40 19 12 40 83 95 34 19 44 91 69 3 30

除2后的余数:3 2 1 1 3 1 2 2 1 1 2 1 3 3 3

归组:C B A A C A B B A A B A C C C

要使三组的动物数相等,须把原归A组的6只动物中1只改编到B组去。可从随机数字表中继续按斜角线抄录一个数字,得60,以6除之(相当于余数为6),就可以把第6个A(即12)动物改编为B组。调整后各组的动物编号如下:

A组:3 4 6 9 10

B组:2 7 8 11 12

C组:1 5 13 14 15

(三)每组一只动物时的分组方法

设有A、B、C、D、E、F代表动物6只兔,试用完全随机法将每只分为一组。

从随机数字表上用铅笔任指一点,若为第21行第17列的33,则从33向左抄录6个数字,然后分别以6、5、4、3、2、1除之。凡除不尽的,即将余数写下。除尽的,写余数时即将其除数写下。如下:

随机数字:33 46 9 52 68 7

除数:6 5 4 3 2 1

余数:3 1 1 1 2 1

随机排列:C A B D F E

上列第1个随机数字余数为3,意即将6个字母中列在第3位的字母C写在该数下,第2个数的余数为1,即在剩下的5个字母列在第1位的A写在该数字下面,依此类推。6个字母相应号代表的兔随机排列结果见上表最后一行。

五、日常饲喂技术

饲料和水的给予是实验中最频繁的动物日常管理,除了遵照既定的饲喂方式外,还需注意如下细节:

为了能给动物提供适量饮水和饲料,宜在实验前粗略测定最小饲养单元(如每笼)的饲料和饮水消耗量,结合动物每日消耗量的参考数据确定实验中给饲的量。

采用颗粒饲料自由采食时,一次给予的饲料量不宜超过动物3天的摄食量,并应每天观察饲料消耗情况是否正常,饲料有否污染变质,3天后将剩余饲料全部撤除,重新给予新鲜的饲料。

颗粒饲料定时定量饲喂时,一次给予的饲料量以动物能够全部吃完为宜。

采用饮水瓶供水时,灌装量通常为容量的2/3~4/5,每天都应观察饮水消耗情况是否正常,饮水有无污染或变质,并在余水量达到容量1/5~1/3时更换水瓶,不得往原水瓶中续水。此外,为了确保水质新鲜,至少每3天应连瓶更换新鲜的水。

应经常检查水瓶和管道供水的水嘴出水情况,及时纠正漏水和堵塞现象。

六、笼具、笼舍的卫生管理

实验中,应根据动物排泄物数量定期清理笼舍、更换垫料、清洗和消毒笼具,为动物提供清洁卫生的小环境。小动物在采用垫料的笼养方式下,应定期全部更换笼具和垫料,而不采用单独更换垫料的方式,更换的频度视垫料被排泄物污染的程度而定,通常饲养密度较小时垫料可维持较长时间,但如糖尿病动物模型等特殊的动物由于排泄量大,需要缩短更换间隔,有时甚至2~3天就必须更换。频繁地更换垫料和笼具对动物的应激会在一定程度上干扰实验观察,应根据研究的需要和动物实际情况确定更换频度,对笼舍的打扫也是如此。

给饲容器、给水容器都应定期清洗和消毒灭菌,屏障设施和隔离设施中有关笼器具都是集中清洗和灭菌,动物饮水的管道系统则定期消毒并监测水质。开放设施中可以在每次使用后清洗并消毒,水瓶、水盆等用消毒液浸泡后以清水除去残留消毒液可直接使用,盛放饲料的容器则应晾干后使用。

七、常用实验动物的日常管理

(一)大鼠和小鼠

大鼠和小鼠是两种目前最常用的标准化实验动物,且已经取消了普通级,必须饲养在屏障设施或者隔离设施内,无论是对动物本身质量的监控还是其饲料、垫料、笼器具配套方面都比较成熟和完善。实验无特殊要求时,大鼠和小鼠均采用自由采食的饲喂方式,饲喂灭菌的全价颗粒饲料和饮水,为确保饲料和饮水的新鲜,应至少每2~3天更换一次饲料和饮水,采用常规的笼具饲养时一般每周换笼一次,适宜的饲养密度小鼠为3~6只/笼,大鼠为3~5只/笼,除非进行繁殖实验,否则必须雌、雄分笼饲养。

(二)豚鼠

豚鼠采用笼(盒)饲养时以每笼(盒)5只为宜,雌雄分开饲养,若用地池饲养可根据面积确定密度,一般不超过10只;采用符合国家标准的配方全价颗粒豚鼠饲料时每天加料1次,如自行配制饲料,应注意豚鼠对粗纤维的需求和消化率较高的特点(38.2%)。每天更换1次新鲜饮水;豚鼠不能合成维生素C,必须靠饮食来补充。根据豚鼠的体重每天加喂维生素C,可加在饮水中以控制维生素C缺乏症的发生;豚鼠垫料最好使用消毒的干草,有发霉变质的草应及时剔除,每周更换垫料2次,术后应勤换垫料和环境消毒,防止感染。水冲式笼养,每天冲粪便不少于3次;饮水具、食具每天清洗消毒1次。豚鼠胆小易惊,应特别注意保持饲养室安静。

(三)地鼠

因地鼠饲料含蛋白量高于小鼠,更易引起发霉变质,应及时清理食剩的饲料,以免引起肠炎。每天换清洁饮水,还可每天适当喂一些新鲜清洁的蔬菜。地鼠牙齿尖利,应特别注意防止逃匿。地鼠的发育和繁殖对温湿度、氨浓度特别是对湿度更为敏感;地鼠垫料一般使用碎刨花,每周更换1~2次。

(四)兔

兔的群居性较差,在实验过程中应单笼饲养,防止打斗咬伤;应控制兔的采食量,避免摄食过多引起肠胃炎,一般成年兔150g/d;用自动饮水器应每天检查饮水装置,以防漏水和管道阻塞,应根据需要给予适量饮用水,并及时更换饮水瓶;粪便每天冲洗2次(如果是自动冲水架,应每天检查自动冲水的运行情况),及时清洗尿碱。

(五)犬

实验期间犬应该单笼饲养和管理,如采用群饲应注意避免相互之间咬伤和交配。药理、毒理实验可采用网上饲养,使动物能与粪便分开,以利于防疫和实验。犬每天都应在活动场地运动2次,每次1小时;成年犬每天喂食2次,幼犬可以再加喂1次,每次喂食要保证新鲜和全价营养,喂后及时取出食具(连同食剩食物),洗刷干净。慢性实验研究的犬必须做好调教工作,使其服从口令,调教工作中注意循序渐进,达到安全的目的。

(六)猕猴

应提供舒适的居住环境,小的生活环境主要包括笼具,笼具材质为不锈钢。笼具的空间足够大,可以让动物自由地躺、卧、转身、站立,甚至玩耍的物品,并有一定的活动空间。大的生活环境主要指饲育室内的温度、湿度、空气质量、照明、噪声等,这些指标均要达到国家标准。有条件的话,还可以为实验动物专门设置定时自动播放的背景轻音乐、录像等,尽可能符合及满足自然生态环境。在动物实验前有必要对每只动物进行必要的训练,如饲养及实验人员与动物的熟悉程度、各种实验操作(麻醉、采血、给药、注射等)的奖赏性训练,使动物能够配合实验人员的操作,以减少动物应激所带来的实验误差,也符合动物福利要求。

(七)猪

猪一般为圈养,根据面积大小每圈1~10头,雌雄分开。单笼饲养便于实验操作、观察,但不利于活动及饲养。无论采用什么方式,每天都要让猪在活动场地运动2次,每次1小时。饲料为粉型或固型,每日给饲料2次,给料量为猪体重的3%左右,如果是仔猪或孕猪、种公猪则应加量,每次喂食完毕应及时取出食具洗净。每天保证新鲜足量的水,特别是夏季。

(八)猫

实验用猫以单笼饲养为宜。每天饲喂2次,饲料配制成半熟料,也可用颗粒料。饮水可选用自动饮水或使用瓶饮水,饮水瓶应每天更换2次新鲜饮水;笼养时应每天更换笼具底托盘,及时清洗干净,室内每周消毒2次,笼具每天消毒1次,保持实验室干净、清洁。食具每次喂完及时取出清洗干净。每天消毒1次。自动饮水器应每天检查其饮水管道、饮水嘴等是否畅通。设施要每天清扫,每个月喷雾消毒3次,避免使用酚类消毒剂,因酚类易引起中毒。猫喜爱清洁干燥的环境,故应保持清洁干燥。

(九)鸡、鸽

实验期间的饲养密度鸡为每笼1~10只,鸽每笼5~30只,单笼饲养便于观察和实验。鸡和鸽一般用饮水器饮水,每天饲喂2次。每天加饲料2次,更换食具1次,更换笼底粪便收集器1次。 Z4RjFuoJPbsDheQ1RCUcI7xcj47mvNMNTk4OHnnFNiJf3skPxZOJ1TcSeFnTEnTK

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