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常规动物实验技术，是指捕捉、保定、个体标识、给药、采血、安乐死等内容，主要涉及非手术性的实验操作。大多数常规动物实验技术是在动物意识清醒、感觉完备的状态下实施的，因此必须特别注意控制这些操作对动物的应激，保护动物免受不必要的伤害，同时避免由此引起的背景性干扰影响实验结果。
常规动物实验技术是各类动物实验的通用技术，但依据不同种属动物的生物学特性，建立了不同的方法和操作。其中，标准化实验动物由于具有明确的生物学特性和广为应用的优势，其实验技术与方法更加成熟、完善。本章系统介绍动物实验设计的基本原则和方法，以及各类常用实验动物的常规实验技术和方法。
动物实验设计（designing of animal experiments）是动物实验的灵魂，良好的设计能确保动物真实反映实验处理的效应，而将非处理因素的干扰降至最低。实验方法和技术决定了实验处理因素，是动物实验设计的精髓。动物实验设计应确立明确的研究目标，并在对研究内容和实验动物基础知识融会贯通的前提下进行，还须掌握必要的统计学原理。
（一）对照性原则
在实验中应设立可与实验组比较用于消除各种非处理因素影响的对照组，对照组和实验组有着同等重要的意义，没有对照的实验结果是缺乏说服力的。设立对照的正确方法是把研究对象随机分配到对照组和实验组。
（二）一致性原则
实验中，实验组和对照组的非处理因素应保证一致，这是处理因素具有可比性的基础。非处理因素存在于动物、仪器、试剂、操作人员、环境等各方面，可以通过设计来消除干扰因素或控制干扰因素趋于一致。
（三）重复性原则
同一处理（一组）应设置多个样本例数，使用足够的样本数来观察处理因素的效应能否在同一个体或不同个体中稳定地重复出来。重复的主要作用是估计实验误差，提高实验结果的真实性和可靠性。虽然样本数越大越能够真实反映整体的状况，但实际的研究不允许无限扩大样本含量，运用统计学方法，可以确定获得理想统计效率的最小样本，从而既能够降低实验误差，又有利于控制实验成本。不同组的样本数可以相等或不等，样本数相等时，统计检验效率最高。动物实验中的参考样本数见表3-1-1。
表3-1-1 动物实验的参考样本数
（四）随机性原则
实验分组应按照机遇均等的原则来进行，其目的是降低主观因素和其他偏性因素造成的实验误差。随机分组最好的方法是借助随机数字，可参照随机数字表，或通过电子计算器、计算机产生随机数字，也可采用编号卡片抽签法等。
（五）客观性原则
确定实验观察指标时，应尽量选择客观性指标，少用带有主观成分的指标，定量指标比定性指标更客观，也更精确和灵敏，主观性指标容易受到判断人员经验、意愿和生理因素等的干扰。分析实验结果时，必须采用科学的方法筛选数据、推理结果，而不能以主观意愿随意取舍数据、改动结果。
（一）实验组别设计
实验处理因素是决定设计方法的关键，这是指为研究目的而施加给动物的外部措施和物质，对单因素实验（一种处理因素）和多因素实验（2种及以上处理因素）需要采用不同的实验组别设计，当一种处理因素包含多个水平或等级时，如一种药物的不同浓度给药，相应地也有不同实验组别设计。
1.自身对照设计
是指在同一动物身上观察实验处理前后某个观察指标的变化，或观察接受处理与不接受处理的相关部位组织的不同变化的设计，前一种情况如观察动物用药前后的变化，后一种情况如使动物一侧肢体实验性骨折，另一侧正常肢体作为对照。该设计有利于消除动物个体间的差异，但不适用于在同一个体上反复多次进行实验和观察的情况，是单因素实验的一个特例。
2.配对设计
在实验前将动物按性别、体重或其他有关因素加以配对，以各因素基本相同的2个动物为一对，然后将这对动物随机分配于两组中，这样的设计可减少个体差异，同窝动物或者一卵双生动物往往用于配对设计，适用于仅有2个组（其中1个是对照组）的单因素动物实验。
3.随机区组设计
是配对设计的扩大，又称配伍设计。将全部动物按体重、性别及其他有关因素分成若干组，每组中动物的体质条件相似，数量则与拟划分的组数相等，称为一个区组，然后将每个区组中的每只动物随机分配到各个实验组或对照组，这种设计可以减少个体差异，并适用于有多个组的动物实验。
4.完全随机设计
是将每个动物随机分配到各组，完全随机设计的操作和统计都较简单，但在样本数较少时难以保证组间的一致性。
5.多因素实验设计
同时分析多种因素的效应，需要采用行列表设计、正交设计等较为复杂的设计方法。
（二）对照组的设置
对照组是进行统计检验的“基准”，是否正确设置对照组在很大程度上决定了对实验结果的科学解释，实验中常设的对照组有以下几种。
1.空白对照
对照组不给予任何实验处理因素，其状况反映了实验动物的“本底”。空白对照组是确定许多观察指标基准值的重要依据，如血糖、血浆总蛋白等血液生化指标。对于一些与时间有关的自发生理改变，如实验期间体重的增长、白细胞计数在一天内规律性的波动等，空白对照提供的信息在正确鉴别实验处理效应时非常重要。自身对照设计中，处理前的个体或者未接受处理的观察部位也可看作空白对照。
2.实验对照
对照组不给予实验处理，但给予和实验处理相同的条件，如假手术对照使动物经历和实验处理组完全相同的手术过程，包括麻醉、打开体腔、缝合等，但不进行结扎、切除、埋植等实验处理，用于鉴别处理条件（手术过程）对处理效应的干扰。随着对动物应激生物学的深入认识，一些以往被认为“刺激性很小或无”的常规实验操作如灌胃、注射、短时保定对动物正常生理状态的影响也逐渐被发现，因此需要通过设立相应的实验对照来鉴别操作过程对实验处理效应的干扰。
3.标准对照
用现有的标准方法或已知确切效果的常规方法作为对照，分为阴性对照（阴性结果）和阳性对照（阳性结果）。在新药的药效学研究中，往往采用已知确切疗效的药物或能引起标准反应的物质作为阳性对照，采用确定无效的物质或药物作为阴性对照，通过比较了解新药的疗效和特点。
4.溶媒对照
当给予动物的受试物质含有可能对动物产生影响的溶媒时，应设不含受试物质的溶媒对照，以鉴别溶媒的潜在效应。
5.历史对照和正常值对照
以本实验室或其他实验室过去的研究结果为对照，或以获得公认、被公布为“正常值”的结果作为对照，可以节省对照动物，但必须十分谨慎，由于不同实验室的研究条件不同，以其他实验室的结果作为对照的可靠性很低，即便是自己实验室以往的研究结果，也可能因为和当前实验的条件有所差别而降低参考价值，这些条件包括从动物到试剂、设备、人员、气候、时间等一系列因素。已公布的实验动物“正常值”如没有注明测定的各项条件如方法、试剂、动物等，则几乎没有可比性，由于目前大多数实验动物“正常值”范围都很宽而注释不详，参考价值通常都很低。
（三）预实验
预实验是指在正式实验前开展的初步实验，其目的是检查各项准备工作是否完善，验证实验方法和步骤是否可行，测试实验指标是否稳定可靠，初步了解实验结果和预期结果间的差距，从而为正式实验提供补充、修正的经验和线索。预实验使用的动物数量可以比正式实验少，但实验方法和观察指标应和正式实验相同。预实验有助于提高正式实验的成功率，减少盲目实验造成的资源浪费，并积累相关经验，是动物实验中不可缺少的重要环节，但预实验的结果不可归入正式实验的最后结果中一并分析。
（一）实验动物的选择
对实验动物的选择包括种属、品种、品系、性别、规格［年龄和（或）体重］等基本内容，有时，研究还对动物的生理状态作出特殊规定，如使用妊娠动物、临产动物等，如果使用的是标准化的实验动物，还要确定动物的生物学净化等级。选择动物的一般程序是首先需确定种属、品种、品系，然后考虑性别、规格、生理状态、净化等级等具体要求。选择实验动物应遵循实验动物应用准则。
1.实验动物应用准则
生命科学研究中，对实验动物的应用必须遵循科学（science）、伦理（ethic）和经济（economy）三个准则，简称“实验动物应用的SEE准则”。动物实验研究必须在SEE准则的指导下，对构成动物实验的一系列研究因素如动物、材料与方法、实验技术、设备与环境等进行正确选择和配置。
（1）科学准则：
实验动物科学准则（science criterion of laboratory animals）是指整个动物实验的方案设计和实施过程必须符合科学规律，具体到动物、方法、技术、环境等要素都必须与实验目的匹配，这是确定动物实验方案时最基本的准则。科学准则不仅涵盖了选择动物时的相似性原则、特殊性原则、标准化原则，而且包括了对动物数量、性别、年龄、体重、生理状态等一般要求的考虑，对实验的昼夜、季节、周期、分组、对照、观察指标的确定，动物的饲育环境、营养供给、质量控制，以及动物实验中饲育管理、实验技术、观察方法的选择与实践等方面的全面内容。
动物实验中，动物、方法、技术和环境构成了密切关联的整体，除了选择符合实验目的动物之外，与动物和实验目的相匹配的研究方法，与动物及操作人员相匹配的技术、与动物和实验要求相匹配的环境等都是实验成功必不可少的部分。在明确研究目的后，各项研究要素和条件与之匹配程度越高，实验的成功率就越高。执行科学准则的意义在于为整个研究奠定科学的基础，确保研究结果的准确性、可靠性、重复性，前提是透彻理解研究目的，并且掌握相关匹配所要求的背景知识。
（2）伦理准则：
实验动物伦理准则（ethic criterion of laboratory animals）是指人道地使用实验动物，这是科学研究者必备的基本素质。动物实验研究必须遵循“健康、快乐、有益”的实验动物福利3H宗旨，在科学研究和尊重生命的天平上取得最佳平衡，为此，研究者应关注动物在研究中遭受的痛苦和不适，充分运用各项动物实验知识和技术，尽量避免对动物不必要的伤害，如适当地使用药物免除动物的疼痛和紧张，掌握并熟练实施规范的动物操作技术，为动物提供合适的环境和护理、实验前充分评估对动物身心的伤害程度并确定应对办法等，研究许可的情况下，用低等生物替代高等动物，用非生命研究手段替代活体动物研究均是伦理准则的体现。
在动物实验中体现人道主义有着科学和人文的双重涵义。从科学的角度，动物在得到人道对待时，对实验因素的反应受到的干扰更小，从而更趋近真实状况，研究结果的可信度就高；从人文的角度，懂得善待动物的人更懂得尊重生命和自然，这是人类文明发展的方向。
（3）经济准则：
实验动物经济准则（economy criterion of laboratory animals）是指动物实验的设计和实施均应体现对资源的节约与合理利用。如药物长期毒性研究中的非啮齿类动物通常可用犬或者猴，由于猴的来源稀少且饲育难度大，维持成本高，犬则来源较广泛，饲育也相对容易得多，因此当研究允许时，使用犬可减少人力、能源和材料的消耗，并有助于保护猴这一物种。
经济准则也体现在时间上，通过对动物和方法等的选择缩短研究周期，有利于加快研发进程，并减少较长研究周期中各种不确定因素对研究的干扰，如避孕药的研究周期和动物妊娠期密切相关，使用妊娠期较短的动物可以缩短避孕药研究周期，加快药物研发进程。
在确保研究质量的前提下，选择来源充足、易于饲养的动物，选择简单明了的方法，选择实验周期较短的方案，选择成熟的、对设备依赖性低的技术，选择能耗低的设备等，都是经济准则的体现。
2.动物遗传背景的选择
对实验动物遗传背景的选择是指对种属、品种、品系的选择，和实验目的匹配是选择的首要原则，也是科学准则的体现，匹配时主要考虑相似性、特殊性、动物寿命和标准化程度等方面，匹配与否直接关系到研究的成败。其次，考虑在不影响研究效果的前提下选择更符合人道和更经济的动物。如实验可能造成非研究需要的剧烈疼痛时，考虑采用对疼痛敏感性较差的动物；当两种动物都可用于同一研究而不会产生差异很大的结果时，就应使用来源更广泛的那种动物。
（1）按相似性匹配：
相似性是指实验动物和目标动物（譬如人）在结构、功能、反应特征上相似。大多数动物实验的目的是通过受试动物的反应预测处理因素对目标动物的作用，因此实验结果通常都要外推到目标动物身上，当两者的相似程度越高，则结果外推的准确率也越大，相似性常常是选择动物时首先考虑的因素。按相似性匹配主要考虑解剖和组织结构、生理反应、代谢过程、疾病特征等方面。
人处于进化树的最高端，总体上，动物的进化程度越高，和人类的整体相似度就越大，如猕猴、猩猩等非人灵长类动物在生物学、行为学上有大量和人类相似的特征，对特定实验因素的反应相近，人类的一些传染性疾病如结核等只能在非人灵长类动物中进行实验性感染研究，在转基因乙肝小鼠研究成功前，狒狒是唯一的人类乙肝动物模型，意识、行为和基础神经研究中仍大量使用和人类有最近亲缘关系的非人灵长类动物。但有些时候，进化程度不高的动物可能在某些特定方面具有和人类的高度相似，如猪的皮肤和人类皮肤的组织结构相似，体表毛发的疏密、表皮厚薄也类似，而不似猴那般多毛，猪的上皮修复再生性与人相似，烧伤后内分泌与代谢的改变也近似，所以比猴更适合用于人类烧伤的研究。用啮齿类、兔等动物制作的疾病动物模型尽管在进化上远低于非人灵长类，但这些动物局部所反映出的与人类相似的疾病过程和临床表现与这些疾病的研究要求相符，正是由于大量利用局部相似性，人类才可能使用各种实验动物开展广泛的研究。
自然选择形成的动物和人类的相似度有限，为此在种的基础上根据特定需求培育了不同品种和品系的实验动物，如封闭群、近交系、杂交F1代，系统杂交动物及来源于各种背景品系的突变动物和转基因动物。这些动物具有人为创造或保留的和人类相似的特性，从而丰富了人们选择动物的来源。封闭群动物具有和人类群体相似的遗传异质性，适合人类遗传研究、药物筛选和毒性试验，近交系、杂交F1代，系统杂交动物、突变动物和转基因动物很多都是人类疾病的动物模型，可以再现某些人类疾病的特征，成为研究这些疾病的理想材料。
（2）按特殊性匹配：
特殊性是指实验动物特有的结构、功能和反应，这些特性和目标动物有很大差异，甚至是目标动物所不具备的，但运用这些特性可以简化研究工作，提高实验成功率等。
一些动物特殊的身体构造可为实验研究带来许多便利，如长爪沙鼠的脑底动脉环后交通支缺损，不能构成Willis动脉环，因而在脑缺血研究中可方便地进行自身对照；犬的甲状旁腺位置固定且位于甲状腺表面，适合于甲状旁腺摘除术相关研究；豚鼠的胸腺全部位于颈部，容易手术摘除，在研究胸腺功能时十分有用；家兔胸腔中的纵隔将胸腔分为左、右不相通的两部分，在需要开胸的研究中如果不损坏纵隔，可以不使用呼吸机。
使用对实验因素敏感性高的动物能够更好地达到实验目的，如家兔易产生发热反应，且发热典型、恒定，很适合用于发热、解热和热原检查等与体温相关的研究；大鼠的垂体-肾上腺功能发达，应激反应灵敏，常用于机体应激反应研究；大鼠踝关节对致炎因子很敏感，故适合多发性关节炎的研究。
动物的特殊反应往往成为研究的有利条件，如兔和猫是典型的刺激性排卵动物，适合于抑制排卵的避孕药研究；豚鼠体内不能合成维生素C，必须从食物中摄取，通过控制饮食中维生素C的含量就可进行相应缺乏症的研究；大鼠的肝脏具有强大的再生能力，切除60%～70%肝叶仍可再生，适合肝外科的研究。
（3）寿命的匹配：
实验动物的寿命必须比研究周期长，才能观察到实验的终点，这对于一些长期实验研究如慢性毒性实验特别重要。对所需寿命的估计应不小于实验周期加上能用于实验的动物最小年龄（或日龄）。常用实验动物寿命见表3-1-2。
表3-1-2 常用实验动物寿命
（4）不同种属的标准化程度：标准化的实验动物具有明确的遗传背景和微生物学背景，依赖于成熟的营养控制和饲养环境控制技术，其来源清楚，背景资料齐全，健康状况明确，是实验动物中的“标准件”，应用标准化的实验动物，不仅有利于排除来自实验动物自身和环境的各类研究干扰因子（准确性要求），也有利于研究结果的横向和纵向比较（重复性要求）。条件允许时，应选用已经标准化的实验动物种属开展实验。目前，我国的标准化实验动物有大鼠、小鼠、豚鼠、兔、地鼠、犬和猴，其中，大鼠和小鼠的标准化程度最高，对犬、猴等动物的应用还存在标准化动物和非标动物并存的情况，在一些地区已经确立了实验用猪的地方标准，实验用猫目前还没有标准。
3.动物性别的选择
选用和目标动物相同的性别，即性别一致，是性别匹配的基本要求。计划生育研究中，通常能够明确该研究针对男性或者女性，从而选择相应性别的动物；肿瘤研究中，子宫癌、卵巢癌等研究必定采用雌性动物。但多数研究的目标动物包括两性，此时需要根据实验反应的性别差异和研究的具体情况来决定使用何种性别的实验动物。
当已知处理效应无性别差异而研究对性别要求又没有明确规定时，通常优先选用雄性动物，这是考虑到雌性动物在性周期不同阶段以及妊娠、授乳等特殊生理状态下的机体反应性有较大改变，可能干扰研究；当实验反应的性别差异仅体现在量的方面，如骨髓微核试验中雄性小鼠比雌性小鼠对诱导微核更敏感，则使用雄性，而如果已知性别导致实验反应有质的差别，则应同时采用两种性别；如需发现和分别确定实验刺激对2种性别的不同作用，如不同的LD 50 ，通常应同时使用2种性别动物且数量相等；如果已知某个性别的特殊反应对研究可能造成干扰时，就应回避这个性别，例如对动物神经内分泌的研究需要避免雌性动物性周期导致的激素水平波动，可以仅用雄性动物进行研究。
4.动物年龄的选择
研究中，使用和目标动物一致的年龄以获得最可靠的结果。当一项研究的预期外推对象没有特定年龄规定时，如多数药物都可针对各年龄段的人群，则使用性成熟的青壮年动物，实践证明如此选择能够满足大多数研究的需求。对于研究周期较长的实验，可适当使用幼龄动物，以确保观察到实验的终点。
年龄匹配的依据在于，不同年龄个体的生物学差异不仅体现在解剖生理特征上，如外观、解剖结构、腺体重量等，也体现在各种生物学功能上，如生长速度、发育水平、成熟度、脏器功能和衰老程度等，并由此导致对同一实验刺激的不同反应。幼龄动物解毒系统多发育不完全，如2周龄以上的家兔肝脏才具备解毒功能，并且在4周龄后才能达到成年兔水平，而大鼠的葡萄糖醛酸转移酶约在出生后30天达到成年大鼠水平，老龄动物解毒功能则发生退化，因此不同年龄对毒物的敏感性一般顺序是幼年>老年>成年，大鼠或小鼠对乙烷、汽油、二氯乙烷的敏感性从大到小的顺序均为幼年>老年>成年。
由于不同种属的动物有着不同的寿命和发育特点，在不同种属间的“年龄一致”是指两者间的年龄对应，即生物学时间上的“同步”，而非天文学时间上的“相等”。如小鼠的一般寿命为2.5年，而人类的寿命约70年，那么1只2岁多小鼠对实验的反应可能是1个70岁的人类才会发生的。由于不同种属在生命各个阶段发育速度不一致，也不能简单地将两种动物按寿命进行等距对应以推算“一致”的年龄，否则，按照16岁的犬相当于80岁的人来推论，就会出现1岁的犬相当于5岁的人的结论，事实上1岁的犬对应15岁的人类。所以除了寿命之外，年龄对应还必须考虑不同种属的年龄阶段对应，实质上是动物在各年龄阶段的生长发育特点对应。
犬和人类的年龄对应关系见表3-1-3。
表3-1-3 犬和人类的年龄对应
图3-1-1 显示了人和常用实验动物在年龄及生命周期上的对应关系。
5.动物体重的选择
体重选择本质上是年龄选择。体重是一个和年龄有一定相关性的生物量。要获得实验动物的确切年龄，就必须准确记录每个动物的出生日期，这在规模化生产的实验动物尤其是大鼠、小鼠、地鼠等小动物中是不现实的，但在特定情况下可以通过动物的体重推算其年龄，从而简化年龄匹配。
由于遗传因素确定后，体重和年龄的对应关系主要受到营养状况和饲养条件的影响，而标准化的实验动物具有较为均一的遗传背景、标准化的营养控制和饲养条件，其体重和年龄间的对应关系较为恒定，尤其在对数生长期具有良好的对应，因此可以根据每个品种、品系的生长曲线，将年龄选择转换为较为简单的体重选择。但对于出生日期不详、遗传背景不清、饲养条件不统一的动物则不能作同样转换。
图3-1-1 人与实验动物的年龄和生命周
图注：↓表示动物的成年时间
此外，同一实验中，动物的体重应尽可能一致，体重的组内差异通常不得超过10%。
6.动物生理状态的选择
对于生理状态的匹配采用等同原则，即根据研究所针对的生理状态选择具有相同状态的动物。实验动物特殊生理状态主要指妊娠、授乳等，处于特殊生理状态中的动物各项功能和反应都与常态动物有很大差别，因此研究中如没有明确规定，应使用未曾交配的性成熟动物，避免特殊生理状态的干扰。
7.动物净化等级的选择
不同的生物学净化等级意味着不同的微生物学和寄生虫学背景，净化等级越高，则相应的背景干扰越小，对于标准化的实验动物，可以通过选择生物学净化等级来限定实验动物的微生物学、寄生虫学背景，从而满足实验研究的相关需求。根据我国的实验动物国家标准（GB 14922.1—2001，GB 14922.2—2001），将实验动物按生物学净化程度分为普通级动物、清洁级动物、无特定病原体（SPF）动物、无菌动物4个级别（表3-1-4），其中清洁动物是根据我国国情而建立的一个级别。在其他一些国家，则分为普通级动物、SPF动物、悉生动物和无菌动物4个等级，其SPF动物应排除的微生物和寄生虫与我国的清洁级动物和SPF动物均不同，从控制的严格程度而言，介于我国的清洁级动物和SPF动物之间。
表3-1-4 我国实验动物的生物学净化等级
对净化等级的选择应当从实验目的出发，而非越高越好，因为许多微生物和机体存在共生关系，是机体维持健康和正常功能所必需的。在我国，目前无特定病原体（SPF）动物和清洁动物是最常用的两个等级。SPF动物由于排除了人畜共患病、动物烈性传染病、隐性感染和潜伏感染、条件致病的病原而被称作“真正的健康无病模型”，适用于大多数科学研究，尤其在中期或长期的研究、一些免疫学研究及生物制品的生产和器官移植中，使用SPF动物可避免大部分条件致病病原感染以及隐性感染、潜伏感染的干扰；清洁级动物也被称作“无疾病症状的模型”，短期的、对动物携带微生物和寄生虫要求不严格的实验可以使用清洁级动物；普通级动物通常不用于正式的科学研究，而用于教学示范和预试。无菌动物和悉生动物则是一类超常的生态模型，仅用于确实有必要排除一切微生物的研究，以及在此基础上研究单一菌种对生物体的作用，或2种菌种在体内的相互作用等。
8.样本量的确定
随机误差的大小与重复次数（样本含量）的平方根呈反比，重复越多，抽样误差越小。样本所含的数目越大或重复次数越多，则越能反映变异的客观真实情况。但若无限的增加样本含量，将加大实验规模，延长实验时间，浪费人力物力，增加系统误差出现的可能性。因此，正确估计一个实验的观察例数，是实验设计的重要内容。
进行样本含量估计要依据以往经验、预实验或文献资料所提供的参考数据。要事先确定的内容有：①所比较的两个总体参数间的差值δ，如δ=µ 1 -µ 2 或π 1 -π 2 ；②总体标准差σ，常以样本标准差 S 估计；③Ⅰ类错误的概率α，一般取0.05或0.01；Ⅱ类错误的概率β，常取0.10或0.20；④把握度即检验效能1-β，通常取0.80或0.90，一般不宜低于0.75，否则易出现假阴性结果；⑤明确取单侧或双侧检验。α、1-β和δ需要根据专业要求，由研究者规定。
设计样本含量应以各组例数相等为前提，估计样本含量可通过查表（统计学家根据有关计算公式编制的样本含量便查表），也可以通过公式计算，下面介绍假设检验中常用的几种样本含量估计方法。
（1）样本均数与总体均数（或配对）比较
方法1：按式计算：
n =［（µ α +µ β ） S /δ］ 2
式中： n 为所需样本含量， S 为总体标准差的估计值，δ为容许误差，µ α 和µ β 由 t 界值表（υ=∞）查得，µ α 有单侧和双侧之分，µ β 只取单侧值。
方法2：直接查配对比较（ t 检验）时所需样本例数表（统计学书籍附表），此表也可用于样本均数与总体均数比较的样本含量估计。
例3-1-1 用某药治疗矽肺患者，估计可增加尿矽排出量，其标准差为2.5mg/dl，若要求以α=0.05，β=0.10的概率，能辨别出尿矽排出量平均增加1mg/dl，问需用多少矽肺患者做实验？
本例：δ=1， S =2.5，单侧α=0.05， u 0.05 =1.645，β=0.10， u 0.10 =1.282，代入公式，得
n =［（1.645+1.282）×2.5/1］ 2 =53.5，取 54
再以尝试法 n =54，υ=54-1=53，查 t 界值表，得单侧 t 0.05，53 =1.674。
n =［（1.674+1.282）×2.5/1］ 2 =54.6，取 55
即趋于稳定。
查配对比较（ t 检验）时所需样本含量表，单侧α=0.05，β=0.1，δ/σ=1/2.5=0.4，得 n =55。与计算结果相同。故可认为需治疗55例矽肺患者。即以55例进行实验，如该药确能增加尿矽排出量，则有90%（即1-β）的把握可得出有差别的结论。
（2）两样本均数比较
方法1：按式计算
n =2·［（（µ α +µ β ） S /δ）］ 2
式中： n 为每个样本所需例数，通常设计两样本例数相等，以提高统计效率； S 为两总体标准差的估计值，一般假设其相等；δ为两均数的差值，µ α 和µ β 的意义同前。
方法2：直接查两样本均数比较（ t 检验）时所需样本例数表。
例3-1-2 比较两种催眠药效果，服甲药后平均入睡时间为40分钟，服乙药后平均入睡时间为25分钟，两药入睡时间合并标准差 S c为30分钟，若使两药差别具有统计学意义（α=0.05，β=0.10），正式实验需要多少只实验猕猴？
本例：δ=40-25=15 分钟， S c=30 分钟，双侧α=0.05， u 0.05 =1.960，β=0.10， u 0.10 =1.282。代入公式，得
n =2×［（1.960+1.282）×30/15］ 2 =84（只）
查两样本均数比较（ t 检验）时所需样本例数表，双侧α=0.05，1-β=0.90，δ/ S =15/30=0.5，得 n =84（只）。与计算结果相同。
按上述公式算得的 n 是基于正态近似原理，一般较查表法（基于 t 检验原理）结果偏少1～2例，有人主张对上述结果再加1～2例作为校正。
（3）两样本率比较
方法1：按式计算：
式中： n 为两样本分别所需例数， p 1 和 p 2 分别为两总体率的估计值， p 为两样本合并率， p =（ p 1 + p 2 ）/2， q 为（1 -p ），µ α 和µ β 意义同前。
方法2：直接查两样本率比较时所需样本例数表，单侧查两样本率比较时所需样本例数（单侧）表，双侧查两样本率比较时所需样本例数（双侧）表。
例3-1-3 某研究者为研究甲、乙两药治疗冠心病效应的差异大小，初步得出甲药显效率为67%，乙药显效率为39%，问若使两药疗效差别有显著性，α=0.05，β=0.1，正式实验时每组需要观察多少只具有该人类疾病的动物模型？
本例： p 1 =0.67， p 2 =0.39， p =（0.67+0.39）/2=0.53，双侧 u 0.05 =1.960，单侧 u 0.10 =1.282，代入公式，得 n =（1.960+1.282） 2 ×2×0.53×0.47/（0.67-0.39） 2 =67 只
（二）实验条件的配置
实验条件是为动物实验研究目的专门匹配的除动物以外的各项环境条件的总和，对于保障实验的顺利进行、实验结果的科学性可靠性至关重要。实验中动物的生活环境完全由人类控制，实验的环境条件不仅是动物实验过程中动物赖以生存的要素，也是人类控制研究质量的关键。实验结果，即动物对实验处理的反应在遗传性决定之后，主要受到环境因素的影响，且在数量性状上受环境的影响很大，环境标准化是动物实验标准化的重要内容，为此实验的环境和饲养条件必须与实验目的以及动物正确匹配。
1.实验设施环境
我国实验动物国家标准中，将动物实验设施的环境分为普通环境、屏障环境、隔离环境3类，不同的环境对应不同净化等级实验动物的饲养和实验观察，见表3-1-5。
表3-1-5 不同环境类型和动物净化等级的匹配
高净化等级的动物不能在“低等级”的环境内进行实验待养，如清洁动物不能饲养在普通环境中，悉生动物不能饲养在屏障环境和普通环境中，否则该动物将被视作自动降级至该环境中的最低等级，如无特定病原体动物饲养于普通环境中，就应算普通动物。降级不仅导致了培育高等级动物所耗资源的浪费，违背实验动物使用的“经济准则”，而且由于低等级的环境中存在更多致病微生物，高净化等级的动物往往缺乏对其的免疫力而更容易感染发病，引起生物安全问题。但进行短期的、急性的、无需动物存活的实验时，由于在较低等级环境中短暂停留一般不会对实验造成明显干扰，也不会给动物的健康和福利带来显著影响和严重后遗症，则可以在较低等的环境中开展高等级动物的实验，其有利之处是节约开支和能源并适度简化工作。
净化等级较低的动物可以饲养在较高等级的环境中，但其净化等级不会随环境类型而改变，普通动物饲养在隔离环境中仍是普通动物，这样做会提高实验成本并且造成资源浪费，同样违背实验动物使用的“经济准则”，如无特别需要一般不提倡。
屏障环境和隔离环境都可用于无特定病原体动物的实验，一般的实验可以在屏障环境中开展，研究中需要保种或对环境中微生物控制极其严格，如要求达到无菌水平，应选择隔离环境。
屏障环境和隔离环境都对应一种以上动物净化等级，但隔离环境是由彼此独立的隔离装置实现的，每个隔离装置内仅容纳一种等级的动物，而屏障环境却是由配置各种屏障的建筑设施实现，仅仅采用“相互独立的房间”无法避免空气和物品的交叉污染，因此在屏障设施内应只饲养清洁级动物或者SPF动物，如果必须将两种级别的动物同时饲养在一个设施内，则必须应用更有效的物理屏蔽如具有独立通风系统的饲养观察设备，以及采取可防交叉污染的措施分别供应两种级别动物饲养和实验所需物品如饲料、垫料、饮水等，确保SPF动物的生活环境及其接触到的一切物品都不会受到清洁级动物的影响，否则和清洁级动物共同饲养在屏障设施内的SPF动物只能降级作为清洁级动物使用。
2.饲养微环境
动物实验中，对动物进行直接操作的时间很少，大多数时间用作实验观察，饲养条件作为实验处理以外的因素，极大影响着实验中动物的生存质量和福利状况。有些实验对饲养条件有着特殊要求，如限量采食、单笼饲养等。一般情况下，应参照有关国家标准和不同动物的饲养规范，根据动物福利的原则匹配饲养条件。
（1）笼具：
笼具的匹配包括笼具选择和使用。笼具主要是根据不同动物的行为习性、生活习惯设计的，体现在高度、宽度、深度、配件等要素上，应使用和动物种类匹配的标准化笼具，如小鼠笼、犬笼等，匹配不恰当可能会造成动物行动受限、身体损伤、死亡或逃逸。笼具的材质应便于实验观察和操作，如透明的PVC笼盒很容易从外部观察动物状况而不会惊扰动物；同时考虑外界环境对笼内环境的影响，如金属栅栏笼也很容易观察动物，但其内部环境如温度、光照、通风都容易受到笼外环境的影响。
笼具的底部大致有实地和网底两种形式，前者便于动物行走、趴伏，有利于笼内的保温，不过需要使用垫料，后者可容动物排泄物自然落下，无需垫料，但容易导致动物足部劳损等问题，局部保温性能也较差，通常实验采用实地笼，但当实验需要观察动物排泄物或阴栓之类的实验指标，或需要排除垫料粉尘对呼吸道的潜在影响、垫料或者粪便被动物采食的可能等，网底笼是更合适的选择。托盘式网底笼采用可单独取出的托盘接纳动物的排泄物，但积聚的排泄物会使空气中臭气物质浓度以及湿度增高，为此可以在托盘中放入吸附性较好的垫料。冲水式的网底笼下有可冲洗的水槽，能够及时除去动物的排泄物，由于用水量大，且会造成较高的相对湿度，通常用于普通级动物的实验中。
选择普通笼具还是净化笼具应结合实验环境的要求，如需防范空气的交叉污染时，可采用净化笼具。代谢笼是专门用于观察测定动物代谢状况的笼具，设计上更多考虑实验观察和样品收集的需求，不宜用作常规饲养。笼具需要进行正确的装配，避免笼盒笼盖和配件“张冠李戴”而影响使用效果，定期清洗和灭菌是笼具使用的基本要求，高压蒸汽灭菌是最理想的灭菌方式，不耐高温的笼具可采取消毒液浸泡等措施。
（2）垫料：
在选择垫料时，首先考虑是否使用垫料，其次是垫料的种类，最后是垫料的灭菌。
用于各类笼具的垫料可根据材质和大小进行分类分级，各种材质和规格都有不同特性，如对臭气的吸附性能、吸湿性能、保温性能、柔软度、黏附性、结团性、动物喜好度等，目前国内最常用的是木质刨花垫料，其具有优良的吸湿保温和吸附性能，并且比较柔软蓬松，适合动物钻越，选用适当的形状和规格则不容易黏附在动物眼、生殖器外周等体表部位，但木质刨花容易产生粉尘，可能干扰呼吸道相关研究，使用前应除尘。此外，需要注意木质刨花材质的安全性，芳香性软质木料如红松、白松、红杉等来源的垫料可释放挥发性碳氢化合物，干扰肝微粒体酶系并具有其他毒性，对药动学、毒动学研究有明显干扰，还可能影响动物繁殖，应避免使用。玉米芯垫料解决了粉尘问题，目前较多用于独立通风净化笼具，但其吸附、吸湿、保温性能以及价格因素制约了其大量推广。其他用于笼具的垫料材质还有纸质的、蒲草的等。干草是常用于圈舍的垫料，一般不需另外加工。
垫料都应消毒、灭菌后提供给动物，以去除其中混杂的寄生虫、野生动物排泄物等有毒有害因素，一般采用预真空的高压蒸汽灭菌，商品化的灭菌垫料有高压灭菌和辐射灭菌的，可直接使用，适合缺乏相应灭菌条件的实验室。
（3）饲养方式：
实验动物饲养方式有笼养和圈养，绝大多数实验都采用笼养方式，猪和羊有时会圈养。由于受到笼子大小的限制，体型中等或较大的实验动物笼养时活动空间狭小，其运动量减少，当实验周期较长时，需要适当给予到笼外运动的机会，如笼养的犬可安排每天定时出笼活动。
（4）饲养密度：
根据最小饲养单元（笼、圈、室）中的动物数量，可将饲养密度分为单独饲养、成对饲养和群饲（3只以上），确定饲养密度需要考虑笼具或圈舍的大小、实验分组、动物的群居特性、实验观察要求等。多数实验动物都是群居动物，3～5只的群饲是最常用的饲养密度。确定每笼或每圈内饲养动物数的主要依据是确保动物最小生活空间，可以参考国家标准以及笼具生产商提供的建议饲养数量。单独饲养是一种比较特殊的饲养密度，严格的单独饲养应是动物处于无法与其他动物交流的状态，常在需要排除动物相互干扰的研究中使用，如一些手术后的观察等，有的动物如小鼠具有较强的群居需求，较长时间单独饲养容易导致精神异常，相比之下，大鼠较能耐受单独饲养，但也会出现更加警觉的表现，对雌性大鼠通常推荐采用群养方式。猫是个例外，由于猫的独立性很强，一般都采用单独饲养。成对饲养适应以1∶1进行繁殖实验的研究需要，一般情况下不考虑。
（5）社会环境：
饲养密度和动物所处的社会环境有着密切联系。成对饲养或群饲时，大多数啮齿类、犬以及猴等都能迅速形成一定的社会等级，由于社会地位和关系会对动物的身心带来特定影响，由此造成群体中每个动物在行为和实验反应中的一定差异。同性别动物成对饲养时，其中1只动物处于主导或优势地位，而另一只则处于从属或劣势地位，有时容易引发动物的争斗或导致两者反应差异增加。群居动物的单独饲养可能造成生长发育和心理等方面的问题。在动物实验中，社会环境是一种较隐蔽的干扰因素，研究中应尽可能为动物提供与其天性相符的社会环境。
3.饲喂条件
（1）饲料种类和给饲器具：
采用天然原料加工而成的各种动物全价营养颗粒饲料是动物实验中的最佳选择，从营养学角度，标准化的全价营养配合饲料具有全面均衡的营养成分，如豚鼠和兔的饲料中含有较高比例的粗纤维以适应其草食动物的生理需求；从物理性状角度，其具有良好的适口性以及符合动物采食习惯的形状，如大鼠、小鼠的饲料具有适合其啃咬的硬度和颗粒形状，颗粒饲料也便于储存和饲喂，并能防止动物挑食。
目前，大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬和猴的配合饲料营养成分均可参照国家标准，由于成分和卫生状况难以控制，不提倡自制饲料用于实验期间动物的常规饲养。大鼠和小鼠的全价营养颗粒饲料商品化生产供应已很成熟，犬也有商品化的全价颗粒饲料，豚鼠、地鼠和兔在使用商品化颗粒饲料的同时，通常还需要补充新鲜的青绿饲料以维持健康，猴需要在饲料之外补充水果、果汁等，新鲜的青绿饲料、水果可以提供丰富的维生素C和纤维素，从而满足动物对营养素的特殊需求（如猴、豚鼠需要额外补充维生素C）以及完成动物在摄食中的天性如咀嚼。实验用猪和羊尚无饲料标准，可以参考养殖业的要求。猫的实验动物化程度较差，为便于实验中的饲料品质控制，可使用各品牌市售猫粮，但不宜经常更换品牌和种类。
清洁级以上动物应使用灭菌饲料。目前商品化的实验动物饲料按灭菌处理分为高温灭菌和辐射灭菌两种，前者饲喂前须进行预真空高压蒸汽灭菌，后者已经过辐射灭菌可直接饲喂，因此更适合缺乏高温高压灭菌条件的实验室。如实验需要自行配制饲料时，也应注意饲料的清洁卫生与动物等级和实验环境匹配。
颗粒饲料通常采用和笼具配套的饲料槽供给，有的与笼盖连成一体，犬和猫常用饲料盆。对容器的要求是能防饲料被动物污染或浪费。需要精确控制营养成分的实验中，可用经提纯精炼的原料或直接使用纯净化合物配制饲料，通常配制成液体饲料、凝胶饲料或者粉状饲料，并使用适合其物理性状的特殊给饲器具。
（2）饮水种类和给水器具：
普通动物可直接供给清洁的自来水，清洁级以上动物则需供给灭菌的清洁自来水或者纯化水，pH3.0～3.5的酸化水可用于清洁级以上动物，但可能干扰动物的生理生化测定结果。
实验动物常用的给水器具主要包括水瓶、水盆、管道供水系统。对给水器具的要求包括能够保持饮水的清洁、便于观察水量的消耗、无泄漏或泼洒、便于清洁消毒又不易破损等。带吸管（水嘴）的透明塑料水瓶适合大多数实验，此种水瓶可用于全部种类的饮水，并且动物很容易学会从水嘴中吮吸，但需要选择合适的大小（容量）。水瓶的容量以一次灌装（4/5瓶）能满足动物3天左右的饮水需求为宜，这是基于水瓶更换工作量以及瓶内水质变化而确定的，大鼠、小鼠的水瓶常用250ml和500ml的规格，许多笼器具配备专门匹配的水瓶，简化了对水瓶的选择。灭菌自来水通常连水带瓶一起灭菌（灌装后灭菌）使用，无需灭菌的自来水和纯化水可在清洗消毒后的空水瓶中灌装后直接供给动物饮用。管道式供水需要建立专门的供水系统，目前多用于纯化水，将饮水通过管道直接接入动物笼舍，可免去换水以及对容器的清洗、消毒、灭菌等工作，在饮水头安装水量监控装置还可监测动物的饮水量。水盆中的水容易受到外界环境的污染，也容易泼洒，正逐渐被淘汰，可用于无法通过吮吸饮水的动物。
（3）饲喂方式：
饲喂方式的选择需要兼顾动物的采食习惯和实验的规定。饮水的供给通常没有时间和量的限制，应随时向动物提供充足的饮水。在饲料的给予中，无特别规定时，大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠都采用不定量、不限时的自由采食，一次性给予动物可维持2～3天的饲料和饮水并每天观察、添加或更换即可。兔、犬、猫一般采用定时定量的饲喂方式。
（三）实验类型、方法和技术的确定
1.急性实验和慢性实验
急性实验和慢性实验是两种完全不同而互为补充的实验类型。急性实验用时短，对实验中各种因素较易从质和量两方面实现控制，人力和物力耗费少，成本较低，但动物处于失常的生理状态，其反应不能说明在生理条件下的功能与活动规律。慢性实验中的动物处于比较接近正常的生活状态，能够保持机体与外界环境的统一性，不过费时费力，成本较高，而且对实验因素的控制难度也较大。采用急性实验还是慢性实验，应根据具体的实验要求来确定。
2.实验方法和技术的选择与优化
动物实验方法和技术决定了对动物的直接操作，研究者依靠这些方法和技术施行实验处理与获取观察指标。同一实验方法可能采用不同的技术来实现。对实验方法和技术的选择应遵循动物实验的3Rs原则，尽可能应用3Rs的方法和技术。
根据应用范围，可将动物实验技术大致分为两大类：常规实验技术和特殊实验技术。捕捉、保定、个体标识、一般途径给药（受试物）、常规生物样品采集、处死等是几乎每个动物实验中都会用到的常规实验技术，各种手术、特殊途径的给药和特殊生物样品的采集则属于特殊实验技术范畴。尽管动物实验技术种类繁多，且永远随着研究的需要而发展，但每项技术都有各自的应用目的和范围，这便是技术选择的主要依据。当有多项技术均可以达到同样目的时，必须进一步考虑动物的种属和个体状况，结合实验具体要求和操作人员的实际水平选择最适宜的技术，在此前提下，还应当考虑技术的优化，以便在顺利完成实验研究的基础上，将该操作对动物的损伤和应激降至最低。
实验技术的优化有两层涵义：用更优化的新技术代替原技术，或者改进原有技术使之更有效率、对动物损伤更小。对实验操作人员而言，前者意味着对优化技术的选择，后者则意味着改良应用。新技术的开发和验证由专门的实验室进行并需要大量投入。目前，尽管各类非接触式测定技术的研究如火如荼，但许多尚未能推广，在研究中不得贸然使用缺乏验证或验证不可靠的新技术。对实验技术的改进通常是一些值得推广的个人或实验室经验，如从小鼠尾部进行微量采血时，由于持续时间较短，通常仅对尾部固定便可操作，就不必使用全身固定装置，减轻对小鼠的心理刺激；用软布遮蔽一些动物的眼睛可帮助其在实验操作中保持安静和镇定，从而减少对其躯体的限制。可以将这些改良技术进一步标准化，以提高推广利用价值。
（四）实验的季节昼夜和周期
在确定实验开展的季节、昼夜和实验周期时，除了研究本身特点和需求外，动物的生物节律也是需要考虑的重要因素。动物的许多生物学功能随季节、昼夜或其他因素如节气等呈现有规律的变化，如巴比妥钠对大鼠的麻醉潜伏期和麻醉维持时间在春秋两季有明显的不同，家兔、犬和小鼠的放射敏感性都随季节而变化，许多基础生理指标如体温、血糖、外周白细胞计数、基础代谢率、神经内分泌等都有明显的昼夜节律，在实验周期跨季度时，或者需要在一天中不同时间进行实验观察和指标测定时，均需要鉴别和防止生物节律的干扰作用。
实验周期的确定还和动物寿命有关，由于不同实验动物寿命不同，同样的实验周期在寿命较短的动物和寿命较长的动物中具有不同意义，如进行为期1年的长期毒性实验，在大鼠（寿命约2.5年）涵盖了一生的大部分生命阶段，但在犬（寿命约15年）则只能反映一个特定阶段的情况。
对动物实验结果的解释和外推是动物实验研究的最后一个环节。动物实验是一种间接测试手段，存在不可避免的局限性，对动物实验结果的解释应当建立在统计推断和该研究的生物学意义的基础上，外推则需要正确分析不同实验动物之间以及实验动物和目标动物之间由于遗传和环境等因素不同所导致的各种差异。
（一）来自种属差异的局限性
由于动物和人类存在着种属差异，有时动物实验并不能使人类预见特定处理的潜在效应，如人类和实验动物对同种药物的敏感性可能存在量甚至质的不同，动物实验无法反映人体用药的效果和毒害作用。曾有人对19种人类摄入会致癌的化合物采用大鼠和小鼠进行研究，发现如果采用现行标准用量，则只有7种能引起小鼠和大鼠的癌症。例如，酞谷酰胺可引起人的先天性肢体缺损，但除了兔和一些非人灵长类，大多数种类的实验动物都不会发展成如同人那样的肢体缺损。提高心输出量的药物Milrinone经诱发性心力衰竭大鼠证明可提高存活率，但对严重慢性心力衰竭的患者却增加了约30%的病死率。实验动物为近现代人类癌症和肿瘤的研究提供了大量线索，但癌症具有明显的种属特异性，对动物实验结果的解释必须结合对癌症患者的临床观察以及临床试验结果，充分利用来源于患者的线索。
使用不同种属的动物进行同一项研究时，不同种属动物之间的差异可能使实验结果的解释更加困难。1988年，《自然》杂志报道的使用大鼠和小鼠同时测试214种化合物致癌性，其反应的一致性仅为70%，而啮齿类和人类的相关性比大鼠和小鼠之间更低，但使用多个种属研究同一个问题却有利于发现种属差异对研究的潜在误导效应，从而避免单一种属研究结果外推带来的风险。所以在新药安全性评价研究中通常要求同时使用2种以上且种属差异大的动物。
（二）来自环境差异的局限性
环境因素是决定生物体演出型的另一个关键因素，实验动物的生活环境相对稳定并受到高度的人工控制，人类所面对的环境中不可控因素则比实验动物多得多，随时可能面临巨大的环境变化，人类还具有多样的生活方式和习惯，一名患者的转归情况可能受到不良生活习惯如吸烟、酗酒、过度疲劳或者不良情绪、突发事件的打击等影响，这些都无法在动物实验中一一复制出来并一次解决。此外，动物实验中许多没有被鉴别出来的干扰因素（实验误差）也会对结果的分析产生一定程度的混淆甚至误导。
（三）来自实验动物自身的局限性
动物实验可以观察到体征（sign），但没有症状（symptom）。大多数实验动物无法表达其主观感受，因此无法从动物实验获得类似于患者主诉的资料，一些反映于主观感觉的毒性效应如疼痛、疲乏、头晕、目眩、耳鸣等在动物实验中难以发现。此外，一个实验组群中通常采用规格一致的动物，但将结果外推及人时，人群的健康状况、年龄、种族等却千变万化，这些因素都难以通过动物实验再现，因而也不是动物实验能够解决的问题。
（杨斐 胡樱）