七、其他检测方法

（一）连接酶检测技术

连接酶检测SNP技术是建立在DNA连接酶对单个核苷酸的高度识别能力基础上的，它可以将两个与模板完全匹配的相邻寡核苷酸片段连接起来。如果连接处出现一个与模板不匹配碱基，连接反应就不能完成。反应体系中包含3种探针，其中一对探针是位于SNP位点上游的特异性等位基因探针，其3’端位于SNP位点上，分别对应SNP的两种基因型。另一个探针位于SNP下游，其5’端碱基为SNP下游第一个碱基。当探针与目的序列结合后，上游等位基因特异性探针的3’端与下游探针5’端紧邻，成缺口状。此时，若上游特异性探针3’末端碱基与模板互补，DNA连接酶识别后，催化上游探针3’羟基与下游探针5’端磷酸基，形成磷酸二酯键，填平缺口，两条探针连接为一条链。若上游探针3’末端碱基与模板不互补，则连接反应不能进行。

等位基因特异性探针可以设计为不同长度，通过电泳检测，或进行不同荧光标记，采用荧光检测技术检测。连接酶反应具有快速、高通量、高特异性、检测费用低等特点。

（二）滚环扩增技术

滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）是1998年建立起来的一种基于连接酶连接、引物延伸与链置换扩增反应的一种等温核酸扩增方法。RCA利用滚环扩增检测SNP，首先需要设计一对针对SNP位点的锁式探针（padlock），锁式探针的两端与SNP位点附近序列互补。当有错配存在时，探针的连接反应就无法完成。RCA具有特异性高、操作简单等特点。

（三）核酸入侵技术

核酸入侵技术（invader assay）是建立在酶特异识别切割基础上的基因分型方法。它是由美国Third Wave Technology公司发展并注册商标的一种基因恒温探针扩增的核酸检测技术。其原理是通过一对寡核苷酸与目标序列杂交形成的特异性三股螺旋结构被切割酶识别并剪切而实现基因分型。

Invader反应体系包括两种探针：一种是Invader寡核苷酸，位于SNP位点的上游，与目标序列互补，3’端的碱基与SNP位点重叠；另一种探针是位于SNP下游的等位基因特异性寡聚核苷酸序列，包含与SNP位点的等位基因互补的核苷酸，5’端包含一段不与模板互补的尾序列（flap）。当两种探针与模板杂交时，形成特殊的交叠三股DNA螺旋结构，重叠点位于SNP碱基上。从古细菌分离出的热稳定瓣内切酶（flap endonucleases，FEN）能识别这种特殊结构并将其剪切，释放出等位基因特异探针的5’ flap。如果等位基因特异性探针与模板不匹配，则不能形成特殊三螺旋结构，就不能被FEN识别，不会发生剪切。在等位基因特异探针5’ flap端标记不同的荧光染料，被切除的5’端尾序列带着等位基因特异性荧光标记，切除后与淬灭基团分离，发出荧光被检测。

执笔：张微　王华梁
审校：平昭　王鹤尧 hmyDfEvYU/KWJRRWzde+hz3IptAygUS8j0XGB/URz7vOQulpShkF9n63O28u/q7S