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摘要： 2017年，在结核病的分子生物学诊断领域主要集中在病原菌的分子生物学诊断为主，且主要以检测病原菌 DNA为主，包括 Xpert MTB/RIF技术、环介导等温扩增技术（LAMP）、线性探针技术、荧光定量PCR技术。RNA检测技术如RNA恒温扩增实时荧光检测技术（SAT）也得到了一定的应用。影响较为深远的是，国家卫生计生委将分子生物学诊断作为结核病确诊的一种重要方法。
关键词： 分子生物学；诊断；结核分枝杆菌；Xpert MTB/RIF；环介导恒温扩增技术；熔解曲线技术；基因芯片；测序技术；RNA恒温扩增实时荧光检测技术
在结核病分子生物学诊断方法中，病原菌的分子生物学诊断在结核病诊断中占据重要地位。病原菌DNA检测是本年度的绝对核心，所使用的技术包括Xpert MTB/RIF技术（简称Xpert）、环介导等温扩增技术（LAMP）、线性探针技术、荧光定量PCR技术和RNA检测技术为RNA恒温扩增实时荧光检测技术（SAT）。
1.Xpert技术
该技术在结核病早诊断中的应用方面具有一定价值。路丽苹等 [1] 对556例上海市松江区结核病定点医院结核科初次就诊的疑似结核病患者的研究中发现：Xpert检测的阳性率为28.12%（151/537）。以液体培养为金标准，Xpert检测的敏感度和特异度分别为90.60%（135/149）和95.84%（369/385）；Xpert检测涂阳标本的敏感度为96.63%（86/89），明显高于检测涂阴标本的敏感度81.67%（49/60），差异有统计学意义。以比例法药敏试验结果为金标准，Xpert检测利福平（RFP）耐药的敏感度为90.00%（9/10），特异度为99.07%（106/107），一致率为98.29%（115/117）。由此得出结论：Xpert技术操作简便、快速、安全，敏感度和特异度较高，对基层实验室早期检测结核分枝杆菌（MTB）及判定RFP耐药具有重要价值。
陈禹等 [2] 报道了Xpert技术以尿液为标本检测结核核酸的结果。119例HIV阴性疑似泌尿系结核的患者中有59例（49.6%）患者临床确诊为泌尿系结核，其中25例（42.4%）经MGIT 960系统培养为阳性；34例（57.6%）按临床表现、泌尿系影像、抗结核治疗效果等临床标准诊断为泌尿系结核患者。以临床确诊为金标准，Xpert检测的敏感度为64.4%（38/59），特异度为100.0%（60/60），抗酸杆菌涂片法敏感度为11.9%（7/59）；MGIT 960分枝杆菌培养法敏感度为42.4%（25/59），与Xpert检测比较差异有统计学意义。在MGIT 960分枝杆菌培养阳性的患者中，Xpert检测的敏感度为96%（24/25）。涂片和培养均阴性而临床诊断为泌尿系结核的患者Xpert检测的阳性率为43.8%（14/32）。Xpert技术优于抗酸杆菌涂片及BACTEC MGIT 960分枝杆菌液体培养等传统泌尿系结核诊断方法，可用于早期诊断HIV阴性的泌尿系结核。
Xpert用于骨关节结核患者的病灶标本检测结果显示 [3] ：若以临床诊断参考标准为金标准，Xpert技术检测的敏感度为78.09%（196/251）；17例对RFP耐药的罗氏药敏检测阳性的标本中，Xpert技术检测结果全部阳性。该技术在用于在脊柱结核诊断，结果显示：Xpert检测诊断脊柱结核的敏感性为76.38%（55/72）、特异性为95.00%（19/20），其敏感性显著高于MGIT 960液体培养（54.60%）和抗酸涂片染色法（27.77%）（ P 均＜0.05） [4] 。
Xpert用于检测156例疑似脓肿性淋巴结核患者的脓液，结果显示：若以液体变色培养基培养试验作为金标准，Xpert试验检测淋巴结核的敏感性和特异性分别为95.42%和84.00%，Kappa值为0.77，两者一致性较好；若以传统比例法药敏试验为金标准，Xpert试验检测RFP耐药的敏感性和特异性分别为70.0%和98.42%，两种方法检测结果比较差异不显著 [5] 。
吴芳妮等 [6] 采用Meta方法，系统分析了Xpert检测在HIV感染者中诊断结核病的效果。纳入的10篇文献涉及到6个国家的来自临床的1878例患者的检测标本。Meta分析结果显示，Xpert在HIV感染者中诊断结核病的汇总敏感度为69%，汇总特异度为97%。按照收集到的标本类型进行亚组分析，Xpert在呼吸道标本中诊断结核病的汇总敏感度及特异度分别为76%和98%，明显高于非呼吸道标本的62%和94%。由此可见，Xpert检测在HIV感染者中诊断结核病的临床价值较高，其对呼吸道标本的诊断效能明显高于非呼吸道标本。
杨元利等 [7] 通过对90例疑似结核性脑膜炎患者的脑脊液进行检测，证实GeneXPert Mtb/RIF技术能快速特异地检测脑脊液中结核分枝杆菌，与抗酸染色和液体培养比较具有较高敏感度，其检测的脑脊液标本经离心浓缩处理后可提高其诊断敏感度。
2.线性探针技术
盛杰等 [8] 评估了线性探针技术在157例患者（127例临床确诊为骨关节结核，30例为非骨关节结核）快速诊断中的应用价值，结果发现：线性探针技术检测的敏感度和特异度分别为76.38%和73.33%，高于结核分枝杆菌培养55.12%及抗酸染色37.01%，差异有统计学意义；三者的特异度分别为73.33%、76.67%和93.3%，差异无统计学意义。与结核分枝杆菌培养及药敏试验相比较，157例患者中罗氏药敏试验检测发现10例为耐药菌株，线性探针技术与罗氏药敏结果一致。
3.LAMP技术
孙娇等 [9] 采用LAMP技术对疑似结核病患者的进行筛查，若以临床诊断结果为参照，LAMP检测、涂片镜检、液体培养、固体培养的敏感度分别为72.78%、51.67%、66.67%和59.17%，特异度分别为88.11%、99.59%、99.59%和99.59%，并且具有良好的一致性。LAMP检测对病程＜1年患者的阳性检出率45.76%明显高于涂片镜检27.12%、液体培养37.05%和固体培养31.48%。当患者出现的临床症状≤5个时，LAMP的阳性检出率（44.37%）明显高于涂片镜检（28.15%）、液体培养法（36.75%）和固体培养法（32.12%）。对于涂片镜检阴性的标本，LAMP技术、液体培养及固体培养阴性标本具有较高的阳性检出率，分别为28.78%（120/417）、21.49%（78/363）和25.90%。
张伟阳等 [10] 对LAMP检测与Xpert的检测效果进行了比较，结果发现：在100例肺结核涂阳标本中，LAMP技术检测的阳性率为96.0%，Xpert检测的阳性率为97.0%；在200例涂阴标本中两种方法检测结果差异有统计学意义（ P ＜0.01），LAMP技术检测的阳性率为53.5%，高于Xpert检测的阳性率（25.0%）。
4.基因芯片技术
杨建林等 [11] 的研究结果显示：芯片法检测与DNA测序针对 Ka G 、 inhA 和 rpoB 基因突变检测准确率分别为75.76%、96.97%。芯片法与痰液培养绝对浓度法药敏分析结果表明：INH一致性系数 k =0.89，RFP一致性系数 k =0.84，芯片法、DNA测序检测突变一致性系数k=0.76。
林秀华等 [12] 以结核性脓胸患者的标本为研究对象进行了研究，结果显示：基因芯片法和快速培养法的特异性均为95.7%，灵敏度分别为48.9%和26.7%，两者比较有统计学差异。基因芯片法检测RFP耐药性灵敏度、特异度和符合率均为100%；而检测INH耐药性的灵敏度、特异度和符合率分别为50%和97.1%和94.4%。
5.脑脊液荧光定量PCR
王俊妨等 [13] 采用此技术对108例临床确诊或疑似的结核性脑膜炎患者和50例非结核性脑膜炎患者脑脊液样本进行检测，结果提示确诊结核性脑膜炎组抗酸染色涂片法、MTB培养法和荧光定量PCR的阳性率分别为9.72%（7/72）、16.67%（12/72）及76.39%（55/72），疑似结核性脑膜炎组分别为5.55%（2/36）、11.11%（4/36）及25.00%（9/36）。将荧光定量PCR与其他2种方法比较，阳性率差异均有统计学意义（ P ＜0.05），荧光定量PCR的敏感性、特异性远远高于抗酸染色涂片法，敏感性高于MTB培养法。
张海晴等 [14] 分别采用罗氏培养法、荧光定量扩增法和SAT-TB比较了用SAT-TB技术在快速检测脑脊液中结核分枝杆菌的临床应用价值，结果发现：96例高度疑似儿童结核性脑膜炎患儿的罗氏培养法、荧光定量扩增法和SAT-TB法检测阳性率分别为40.63%、39.58%和42.71%，三者差异无统计学意义；以罗氏培养法作为金标准，SAT-TB法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、正确指数、误诊率、漏诊率、诊断符合率分别为92.31%、91.23%、87.80%、94.55%、0.84%、8.77%、7.69%和91.67%；荧光定量PCR法的各项指标分别为66.67%、78.95%、68.42%、77.59%、0.46%、21.05%、33.33%和73.96%。由此证明SAT-TB在检测儿童结核性脑膜脑脊液标本中的结核分枝杆菌时，具有快速、敏感度和特异度较高等优点。
纪丽微等 [15] 将SAT技术与Xpert技术在痰标本中进行了比较，结果发现：2284例患者中1097例为活动性结核病患者、1187例为非结核患者，Xpert阳性检出率最高，与SAT技术比较差异均有统计学意义；Xpert法敏感性（50.14%）和特异性（100%），高于SAT技术，两者比较差异有统计学意义。
张青等 [16]] 采用Meta分析的方法比较LAMP技术、SAT技术和Xpert技术在诊断肺结核方面的敏感度和特异度。结果发现：LAMP技术、SAT技术和Xpert技术在诊断肺结核的合并敏感度和特异度分别为93%和94%、96%和88%、89%和98%，但不一致指数（ r ）均大于80%，提示存在研究间的异质性。在随后根据痰涂片状态和HIV感染进行的区组分析中，用LAMP技术诊断痰涂片阳性的肺结核患者，其敏感度由93%上升至98%，特异度降低至68%；用Xpert法诊断 HIV阴性的传染性肺结核患者，其敏感度和特异度分别为72%和99%。
2017年，国家卫生计生委 [17] 发布了结核病诊断的卫生行业标准，该标准纳入了分子生物学诊断，其中结核分枝杆菌核酸检测阳性且配合影像学诊断就可以确诊为肺结核病。另外，结核性胸膜炎、气管、支气管结核的病原的分子生物学检查阳性也可确诊为结核病。
综上所述，国内结核病的分子生物学技术的应用探索研究得到进一步加强，以Xpert为主的分子生物学技术得到进一步肯定，由此推动了肺结核诊断标准中引入并肯定分子生物学诊断的价值。
（孙照刚 孙炳奇 韩利军 李欢 常蕴青 唐神结）
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2.陈禹，刘旭晖，付亮，等.GeneXpertMTB/RIF在HIV阴性泌尿系结核中的诊断价值.中国防痨杂志，2017，39（10）：1100-1106.
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6.吴芳妮，黎友伦.GeneXpertMTB/RIF在HIV感染者中诊断结核感染效能的Meta分析.中国防痨杂志，2017，39（3）：269-276.
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