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摘要： 结核病依然威胁着人类健康，2016年全球新发结核病患者约1040万与上一年持平，约167万人死于结核病，是全世界的第九大死因，已超过艾滋病，在传染性疾病中排第一位，我国新发结核病患者居世界第三位。因此迫切需要更高保护效果的疫苗出现，由我国自主研发的治疗性疫苗微卡正在进行Ⅲ期临床试验阶段，当前仍需加快新型结核病疫苗研发进度，建设标准化的疫苗评价流程，进一步完善疫苗临床前研究评价体系，促进从新型结核病疫苗从研究到临床试验，最终应用到临床的快速转化。
关键词： 结核病疫苗；重组亚单位疫苗；微卡；安全性；免疫原；佐剂
2017年我国科研工作者在结核病疫苗研究领域取得了一定进展，设计并评价了多种重组亚单位疫苗、病毒载体疫苗、重组BCG等新型结核病疫苗；利用组学技术对微卡疫苗进行了深度挖掘和分析，通过荟萃分析评价了微卡对肺结核的免疫治疗效果；发现了Rv2351c、Rv0585c等具有疫苗研发潜力的新抗原；评价了多种佐剂的使用效果；发明了一种新的基于微针阵列技术的疫苗接种方法。
1.蛋白亚单位疫苗
具有疫苗潜力的结核分枝杆菌保护性抗原仍然是研究重点。潜伏感染或活动性结核病状态下结核分枝杆菌的代谢不同，其抗原的表达也有所差异，选择可被潜伏感染或活动性结核病来源的T细胞识别的蛋白，可作为疫苗候选抗原。华中科技大学Ma等 [1] 选择了结核分枝杆菌不同感染状态下特异性表达的4种蛋白Rv2875、Rv3044、Rv2073c和Rv0577，构建了融合表达蛋白CMFO，并以DMT为佐剂，设计了亚单位疫苗CMFO-DMT，并对该疫苗的保护效力进行了评价研究。通过小鼠原发感染模型实验，发现其保护效力优于CTT3H-DMT，与BCG及重组亚单位疫苗A1D4-DMT保护力相当；在小鼠的潜伏感染模型实验中，CMFO-DMT组小鼠肺及脾脏的细菌载量明显低于其他各组，病理损伤也最小；在小鼠复发感染模型实验中，小鼠首先以BCG免疫，4周后感染H37Rv，之后以BCG为对照组，分别采用CMFO在内的3种亚单位疫苗加强免疫，结果显示CMFO-DMT组小鼠肺部及脾脏的细菌几乎被全部清除，其他组别较对照组无显著差异。通过ELISA实验，分析了CMFO的免疫原性，小鼠CMFO特异的IgG，IgG1和IgG2a表达水平显著高于BCG组；CMFO-DMT组的Th1型细胞因子IFN-γ，IL-2和TNF-α显著高于BCG组；此外CMFO-DMT可以诱导小鼠脾和肺部产生更多的效应T细胞和中央记忆T细胞，且可通过驱动BCG致敏小鼠的这两种细胞向肺部感染部位募集以抵御潜伏感染和防止复发。该研究通过小鼠模型证实CMFO-DMT亚单位疫苗既有较好的预防结核效果，又具有一定的免疫治疗作用，但这一结论仍需要更多动物实验数据支持，其安全性也有待更全面的评估。
Xiang等 [2] 筛选了5种Esx蛋白，EsxB、D、G、U、M，异源融合表达并命名为BM，配以弗式不完全佐剂免疫小鼠，结果显示BM有较高的免疫原性，可诱导小鼠产生高水平的Th1型细胞因子IFN-γ和TNF及CD4 + T细胞，通过免疫BALB/c小鼠，静脉注射10 7 CFU M . bovis BCG，3周后检测肺部及脾脏的细菌载量，结果BM组细菌CFU数最低，优于目前已经进入临床试验评估阶段的PPE18、Ag85A等亚单位疫苗，其较好的保护效力可能是由于融合蛋白包涵了更多的T细胞表位。该疫苗也有望经过近期更全面的动物实验评估和安全、稳定性评价，尽快进入到临床试验阶段。
蛋白亚单位疫苗AEC/BC02是由重组MTB抗原Ag85b、ESAT6及CFP10与复合佐剂系统BC02（即BCG-CpG-DNA+A1）所构成，已获批进入临床试验阶段。卢锦标等 [3] 评价了异烟肼联合该疫苗对豚鼠感染结核分枝杆菌的治疗效果。共30只豚鼠采用皮下注射方法进行豚鼠攻毒试验，1周后按不同治疗方式设置组别，INH联合AEC/BC02治疗组，前两周INH给药，之后肌注疫苗。攻毒后第10周解剖分析脏器病变情况与细菌载量。病理结果显示，各组豚鼠的肝脏、脾脏和肺脏均出现不同程度的以肉芽肿病灶为主的病理改变，病变程度由轻到重依次为INH+AEC/BC02组、INH组、AEC/BC02组和NS组。INH+AEC/BC02组的脾脏和肺脏细菌载量最低。表明INH联合AEC/BC02疫苗使用明显提高了对豚鼠的保护作用，能减轻脏器病变，降低脾脏和肺脏的活菌载量。首先用抗结核药物杀死大多数活跃的MTB，减轻病变部位的炎症反应，再用治疗性疫苗激发免疫系统，清除残余细菌，探索了结核病治疗的新思路。
结核分枝杆菌Ag85A及Ag85B一直是结核病疫苗研究的热点抗原。Liang等 [4] 构建了重组融合蛋白Ag85AB，以短小棒状杆菌为佐剂设计了疫苗rAg85AB+CP，并对其免疫原性进行了评价。通过每隔2周给小鼠肌注疫苗，共3次，结果rAg85AB+CP组释放γ-干扰素的T细胞显著多于其他组，特异性IgG抗体水平也显著高于对照组，IgG2a/IgG1比值提示该疫苗可诱导较强的Th1细胞免疫应答。该研究通过小鼠攻毒实验，评估了其免疫治疗效果，发现高剂量的疫苗辅助杀菌效果更佳。
2.重组DNA疫苗
结核病DNA疫苗起步较晚，近年来取得了一定进展，但其免疫学机制及免疫策略和途径，仍是值得关注和研究的焦点问题。徐佳等 [5] 设计了pCDNA3.1+Ag85A，并用脂质体包裹制成结核口服DNA疫苗。动物模型选择C57BL/6小鼠，分3次进行灌胃免疫，间隔期2周，对照组灌注等量生理盐水。实验组免疫组化结果显示Ag85A在靠近固有层的小肠黏膜上皮细胞中的表达强度高于靠近肠腔侧的小肠黏膜上皮细胞，在小鼠小肠派氏淋巴结内的树突状细胞中也有表达，但表达的细胞数量较少。本研究只检测了Ag85A抗原的表达情况，对于是否有效启动了黏膜免疫应答，及其免疫保护效力及安全性评价等工作仍有待开展。
Sun等 [6] 设计了pcDNA3.1-Ag85A-IL-15疫苗，并对其进行了评价。通过肌内注射分3次免疫小鼠，发现pcDNA3.1-Ag85A-IL-15组（即使用IL-15佐剂时）较其他对照组（pcDNA3.1、pcDNA3.1-Ag85A）的小鼠在支气管肺泡灌洗液中可检测到更高水平的IgA，血清中Ag85A特异性的IgG抗体也显著高于其他组，IgG2a/IgG1比例显著上调，NK细胞活性增加，促进了脾脏中Ag85A特异的T细胞增殖，促进了CD4 + T细胞向Th1型极化，并诱导分泌了更高水平的IFN-γ。以上结果提示佐剂IL-15可能主要与CD4 + T细胞、CD8 + T细胞及NK细胞的增殖相关。此外，以细胞因子作为疫苗佐剂可在一定程度上避免了安全性问题，IL-15的应用前景较好。
病毒载体疫苗研究是结核病疫苗研究的热点之一，有3种病毒载体疫苗已进入Ⅰ期临床试验。以病毒为载体构建的结核病疫苗主要用于免疫加强或预防性免疫。宁夏大学Wu等 [7] 选择了CFP10、EAST-6、Ag85A和Ag85B 4种结核分枝杆菌抗原，并以腺病毒载体分别进行了异源表达，构建了Ad5-CEAB疫苗，并利用小鼠模型评价了BCG初次免疫-Ad5-CEAB加强免疫的免疫策略，与对照组相比，经抗原刺激后的小鼠淋巴细胞会分泌较高水平的IL-12和IFN-γ，可有效的刺激小鼠血清产生较高水平的IgG抗体，另外，小鼠肺盥洗液中sI-gA的浓度也显著高于对照组。研究发现采用BCG初免-单次Ad5-CEAB加强的免疫策略能够刺激小鼠产生较强的免疫应答，但该研究尚缺乏动物模型攻毒实验证据，其实际的保护效果也有待进一步研究。
重组BCG疫苗仍是结核疫苗研究的主要思路之一。Liu等 [8] 使用pMV361载体及强启动子hsp60，设计了融合表达载体pMV361-Ag85B-IFN-γ，转化 BCG构建重组BCG疫苗rBCG：：Ag85B-IFN-γ。通过免疫C57BL/6小鼠，发现其较BCG可诱导小鼠脾脏产生更多的IFN-γ和TNF-α；当免疫小鼠6周时和12周时，ELISA结果显示rBCG：：Ag85B-IFN-γ组诱导产生的IgG抗体显著高于较BCG组，IgG2/IgG1比例提示该重组BCG疫苗可诱发更强的Th1型免疫应答，且6周时所检测的结果优于12周；此外，该重组BCG疫苗可诱导产生更高水平的NO，以及促进脾脏抗原提呈细胞的增殖。流式分析结果提示，rBCG：：Ag85B-IFN-γ活化CD4 + T细胞的能力优于BCG，且可促进多功能T细胞的产生。体外细胞实验结果表明，其可诱导单核细胞THP-1细胞CD80、CD86、CD40和HLA-DR的等CD分子和细胞表面受体的表达。该研究提示rBCG：：Ag85B-IFN-γ可作为结核治疗性疫苗的候选之一，但其安全性和稳定性仍有待进一步研究。
薛士鹏等 [9] 运用类似的方法设计了重组BCG疫苗rBCG-Rv2029c，Rv2029c蛋白之前已被证实是结核分枝杆菌潜伏感染相关的抗原，被期望用于结核病的免疫治疗，但尚缺乏足够的动物实验证据及安全性评价等相关工作。
M . vaccae 是目前唯一进入临床Ⅲ期的候选疫苗，由中国药品生物制品检定所和解放军309医院研制，安徽龙科马生物制药有限责任公司开发并独家生产，是WHO在结核病免疫治疗方案中唯一推荐的品种。Zheng等 [10] 从蛋白质组-基因组水平对微卡疫苗进行了深度挖掘和分析，通过全基因组测序对微卡进行了基因注释，其GC含量高达68.6%（高于结核分枝杆菌），预测有5732个蛋白，推测4535个为功能蛋白，其余为假设蛋白，预测90%的蛋白与其他结核分枝杆菌属菌株同源。通过蛋白电泳及一级质谱得到了22 508个肽段，对应3387个蛋白，进一步用MALDI-TOF/TOFMS二级质谱进行了鉴定，证实445个N-端存在翻译起始位点。通过2-D电泳获得微卡蛋白表达谱，通过比较结核病患者与健康对照血清与微卡蛋白表达谱的Westernblot免疫印迹斑点差异，通过质谱鉴定得到35个显著差异抗原蛋白，选择其中20个蛋白进行过表达，通过体外体液免疫及细胞免疫反应验证其免疫原性，找到8个抗原在肺结核患者组的血清学反应较强，及1个抗原（MYVA_1927）在肺结核患者组引起更强的细胞免疫反应。这些研究结果将有助于揭示微卡疫苗在调节机体免疫过程中的具体作用机制。
结核分枝杆菌Rv2351c编码的PlcA蛋白在之前的研究中被认为与MTB的致病性有关。Wang等 [11] 利用TEpredict等生物信息学分析工具预测Rv2351c编码氨基酸序列有20个可被T细胞识别的抗原表位，异源表达PlcA蛋白，并以二甲基三十六烷基胺（dimethyl-dioctyldecylammonium bromide，DDA）和Poly（I：C）为佐剂设计了亚单位疫苗DP-2351c，并评估了该疫苗的免疫原性。通过免疫小鼠，检测到Rv2351c特异的IgG、IgG1、IgG2a表达水平均显著高于Ag85B对照组，IgG2a/IgG1比例2～4，提示Rv2351c较Ag85B可更好的地导在抗结核过程中起关键作用的体液免疫和Th1型免疫反应，可刺激小鼠产生更多的IFN-γ和IL-4启动细胞免疫应答。该研究发现了抗原Rv2351c在小鼠体内有较好的免疫原性，不足之处在于缺乏攻毒实验数据，进一步探讨其免疫保护力，缺乏组织病理等说明其安全性问题的实验数据。
生物信息学分析是发现新抗原的重要手段，刘思静等 [12] 运用生物信息学软件预测了结核分枝杆菌酪蛋白酶clpP2含义较多的潜在细胞毒性T细胞及辅助T细胞抗原表位，同时含有6个B细胞线性和6个B细胞构象表位，认为其具有疫苗开发前景。杨丹等 [13] 用类似的方法预测了结核潜伏感染蛋白Rv2657c的抗原表位，发现其有5个B细胞表位，6个T细胞表位及6个CTL表位，以及38个Th细胞表位。这些表位是否能有效刺激免疫应答，仍有待实验证实。
王雪枝等 [14] 通过生物信息学预测分析了Rv0585c的抗原表位，通过免疫小鼠研究了该蛋白的免疫原性。经生物信息学预测到Rv0585c 66个人T细胞抗原表位，选取合成了表位分布集中的9条抗原表位多肽。人群ELISpot试验筛选出3个阳性人T细胞表位多肽：P10110、P10112、P10117，用于肺结核检测时灵敏度较低，但特异度可达97.96%以上。动物免疫试验结果显示，不同剂量多肽P10110和P10112刺激小鼠产生较高水平的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10，且均高于阴性对照组。提示Rv0585c蛋白及其T细胞表位具有较好的免疫原性及免疫反应性，可刺激机体产生较强烈的细胞免疫应答，具有一定新型结核疫苗的开发价值。
随着新型疫苗的不断涌现，也推动了疫苗佐剂的研究。Sun等 [15] 在一项研究中评价了以CFP10-TB10.4（简称CT）融合蛋白为抗原，8-臂PEG作为抗原投递系统，分别以铝-洛索立宾（Aluminum-loxoribine mixture，A-L）和聚肌苷酸胞苷酸[poly（I：C），P]为佐剂的所构成的亚单位疫苗有效性及安全性。通过接种BALB/c小鼠实验，与CT组相比，CT-PEG组抗原特异的IgG滴度显著升高，表达了更高水平的Th1-和Th2-型的细胞因子，以及CD4 + IFN-γ + 和CD4 + IL-4 + T细胞比例较高。A-L和poly（I：C）均可提高CT-PEG的免疫应答能力，且两者无显著差异。在SD大鼠开展的药代动力学实验结果显示，8-臂PEG延长了CT蛋白在循环系统的时间以及在免疫系统的暴露时间；CT-PEG结合A-L佐剂对大鼠脏器无明显毒性作用，CT-PEG结合poly（I：C）则对大鼠脏器有一定的毒性作用。因此本研究认为CT-PEG/A-L是一个安全有效的抗结核分枝杆菌感染的疫苗，其后续研究值得期待和关注。
目前，病毒载体疫苗主要以腺病毒（Adenovirus）和安卡拉痘苗病毒（modified vaccinia virus Ankara，MVA）为主。Kou等 [16] 以Ag85B-TB10.4融合蛋白为抗原，MVA为载体设计了重组病毒载体疫苗，并在该载体上引入了组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，tPA）信号肽序列以增加抗原蛋白的表达和分泌，tPA可被认为是一种佐剂。采用初免加强的策略免疫小鼠，发现tPA信号肽的引入可显著提高抗原特异性抗体水平，同时提高了IFN-γ、TNF-α、IL-5及IL-6等细胞因子表达水平，提高了活化T细胞的数量。IgG2a/IgG1比例没有变化，说明tPA提高了疫苗的免疫原性，但没有改变Th1型和Th2型免疫应答的平衡状态。该疫苗的保护效力仍有待进一步验证。
Yu等 [17] 以结核分枝杆菌融合蛋白-Rv3407-PhoY2-Ag85A-Rv2626c-RpfB（WH121）为抗原，以MTO（由单磷酰脂质A，海藻糖-6，6’-二山嵛酸酯，MF59组成），结合热灭活的微卡（Mv）构成复合佐剂MTOM，组装为WH121/MTOM亚单位疫苗。该研究以WH121/MTO及WH121/Mv为对照组，通过小鼠实验对3种疫苗的免疫原性进行了评价和比较，发现WH121/MTOM抗结核保护作用优于其他两组，MTOM显示了更强的诱导产生单功能及多功能IL-2 + T细胞的能力，且可诱导更强的Th1型免疫应答。MTOM在未来亚单位疫苗的研发中有一定的应用前景，其安全性和保护力有待更全面的评估。
卡介苗接种是皮内注射，其他疫苗接种方式多为肌内注射。Chen等 [18] 发明了一种新型接种方式——微针阵列（microneedle array，MNA），可以无痛、无损伤将减毒冻干活BCG疫苗输入表皮内。与皮内接种相比，BCG-MNA接种方式无强烈的皮肤刺激，不会引起严重的炎症和组织损伤，通过一系列实验证明通过MNA与皮内注射的两种接种方式，其免疫保护效力相当。MNA常温可保存60天以上，不影响其穿透能力及疫苗活力，该接种方式更方便可行，且无痛，不造成皮肤损伤。BCG-MNA能否替代皮内注射仍有待一定规模的临床试验来验证。
（王伟 常蕴青 李平俊 朱国锋）
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