第一节
实验原理

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种根据DNA复制原理而设计的体外DNA扩增技术，是指由一对特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物介导的基因或克隆的特定DNA序列的酶促扩增的反应过程。整个过程由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dNTP为原料，按照碱基配对原则进行半保留式复制，合成一条新的与模板DNA链互补的链。重复上述变性-退火-延伸的循环过程，多次循环，即可扩增特定DNA片段。通常每完成一个循环需时2～4分钟，2～3小时就能把靶核苷酸扩增放大几百万倍。

实时荧光PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，从而实现对起始模板定量及定性的分析。主要可分为TaqMan实时荧光PCR、双链DNA交联荧光染料实时荧光PCR、双杂交探针实时荧光PCR、分子信标实时荧光PCR、蝎形探针实时荧光PCR、数字实时荧光PCR等。TaqMan实时荧光PCR是以TaqMan荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术，目前国内临床核酸诊断中应用最广泛。其主要原理为TaqMan荧光探针在其5'端标记一个荧光报告基团，如FAM，TET，HEX等，在3'端有一个淬灭基团，如TAMRA等。根据荧光共振能力传递（FRET）原理，探针完整时，荧光基团和淬灭基团距离很近，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收而不能发出荧光信号。当进行PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，这时荧光即可发射出来，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步，见图8-1。

用于检测Tp的靶基因主要有tp47、polA、16S rRNA、tpf-I、bmp、tnpA、tnpB等，其中tp47、polA特异性最高。常用于Tp的PCR方法有常规PCR、反转录PCR、巢式PCR、多重PCR、实时荧光PCR等，其中实时荧光PCR方法应用最广泛。 VU7scEsE7M/7R6oeoe9SII1UcEuycvRzeIlW6T/17NtIXQEuL0bwi59wc809yO9e