第三节
实验检测

一、实验材料

（一）仪器设备

1.暗视野显微镜　暗视野显微镜是利用丁达尔（Tyndall）光学效应的原理，在普通光学显微镜的结构基础上加装暗视野聚光器而成。

暗视野聚光器工作原理：当光线照射时，由于该聚光器内部抛物面结构的遮挡，照射在待检物体表面的光线不能直接进入物镜和目镜，仅散射光能通过，因而视野是黑暗的。暗视野显微镜由于光线不能直接射入观察系统，无物体时视野黑暗，无法观察到任何物体；当有物体时，物体衍射回的光与散射光在暗的背景中明亮可见。但是，由于物体所在的位置结构，厚度不同，光的散射性、折光等都有很大的变化（图5-2）。

2.暗视野聚光器　分为干式暗视野聚光器和湿式暗视野聚光器（图5-3）。

3.物镜

10×，用于对焦样本和调整聚光器的亮度。

40×，用于观察样本。

100×，要求镜头具有可调数值孔径（the numerical aperture，N.A.），孔径范围0.625～1.25，以满足暗视野的使用，主要用于进一步鉴定螺旋体。分为加油和不加油两种物镜。

4.载玻片　1×3英寸大小，载玻片的厚度对暗视野检查非常重要，一般采用厚度为1.0～1.2mm的载玻片。

5.盖玻片　盖玻片尺寸为22mm×22mm，盖玻片需要非常干净和无任何刮痕。

6.注射器1ml注射器。

7.注射针头12号针头。

8.擦镜纸。

（二）试剂

1.0.85%无菌生理盐水。

2.消毒用75%酒精或碘酊。

3.非病原性的螺旋体质控片

齿垢密螺旋体质控片制备：加一滴生理盐水在载玻片上，挑取齿垢与生理盐水混合，盖上盖玻片制成厚薄适中的质控片。

二、检测步骤

1.把样本载玻片放在已调校好的暗视野显微镜的载物台上。

2.载玻片置载物台上，调整干式暗视野聚光器使入射光线的强度适中。如为湿式暗视野聚光器，则滴加一滴水于聚光器上，并上升聚光器使水接触载玻片，先用10×物镜调整使物像清晰，再用40×物镜观察，寻找有特征形态和运动方式的梅毒螺旋体。

3.观察时采用从左到右，从上到下的顺序，仔细地、系统地寻找可疑梅毒螺旋体（图5-4）。

4.当40×物镜找到疑似梅毒螺旋体时，如有条件可用100×专用暗视野物镜进一步观察螺旋体形态及运动性。

5.暗视野显微镜下，典型的梅毒螺旋体呈白色发光，其螺旋较密而均匀。运动规律，运动性较强，其运动方式包括：①旋转式，围绕其长轴旋转；②蛇行式，全身弯曲如蛇行；③伸缩其螺旋间距离而移动。观察其运动形式有助于与其他螺旋体相鉴别（图5-5）。

6.检查完样本后，把载玻片丢入装有合适细菌消毒液，如10%次氯酸钠消毒液的容器中。

7.检查完成后，用擦镜纸和镜头清洁剂把油镜、载物台以及暗视野聚光器擦拭干净，注意用擦镜纸以保护好物镜镜头。保持显微镜无油渍和灰尘以确保其正常工作状态。

三、结果报告

1.可见螺旋体

暗视野显微镜下梅毒螺旋体为纤细、白色、有折光的螺旋状微生物，长5～20μm，直径小于0.2μm，有6～12个螺旋，具有旋转、蛇行及伸缩等三种特征性的运动方式。暗视野显微镜下观察到具有上述特征的螺旋体则报告阳性结果。注意梅毒螺旋体与其他螺旋体的区别（表5-1）。

2.未见螺旋体

暗视野显微镜检查未发现螺旋体。

四、结果解释

暗视野显微镜查出螺旋体可作为一期梅毒、二期梅毒和早期先天梅毒病原学诊断的依据。未经治疗的一期梅毒（早期）的硬下疳组织液，暗视野检查阳性而血清学结果可为阴性；一期梅毒（后期）、二期梅毒暗视野检查阳性时，血清学试验阳性。否则，应分析暗视野或者血清学可能出现的假阳性或假阴性情况。假阳性结果可出现于口腔及直肠样本，此时，需采用直接免疫荧光方法检测予以确证是否为梅毒螺旋体。

未检出螺旋体不能排除梅毒的诊断，阴性结果可能说明：①螺旋体数量不足（单次暗视野显微镜检查阳性率小于50%）；②患者已接受抗生素或杀灭梅毒螺旋体的药物治疗；③损害接近自然消退；④损害不是梅毒。对于暗视野检查阴性，但临床高度怀疑早期梅毒的患者，应多次多部位（包括抽取淋巴结液）重复检测，或1周、1月、3月后重复血清学检测，如均为阴性可排除梅毒。

五、注意事项

1.暗视野显微镜在检测患者样本前需做好调校，使其保持在最佳工作状态。

2.实验使用的载玻片和盖玻片必须非常洁净和没有刮纹，载玻片的厚度为1.0～1.2mm。

3.采集皮损样本时要尽量避免混入血液、组织碎片或纤维丝影响结果观察。

4.口腔及直肠样本不适于暗视野检测，必要时采用直接免疫荧光检查。

5.生殖器部位样本要注意梅毒螺旋体与生殖器部位正常菌群之一溃蚀齿密螺旋体区分（表5-1）。

6.组织液压片时，如样本量足够，则不加盐水，以提高阳性率。

7.100×物镜孔径必须是可调节，范围0.625～1.25。

8.样本采集后5～20分钟内必须检查完毕，否则会随着时间的延长而使螺旋体动力减弱或完全失去动力影响结果观察。

9.样本中含有过多的红细胞、气泡、组织碎片或样本干燥，建议重新采集样本检测。 wzFBAEBxN/Ngsa6oRNK6FsC72ETd2Cw+LxlaxADDzdr86XDVQY1q8lSKVGgywyQK