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摘要： 我国仍然属于结核病高负担国家，耐药结核病的流行状况不容乐观。了解耐药结核分枝杆菌基因型分布、耐药突变类型和耐药突变与耐药水平的关系，对于临床诊断和耐药结核病控制有重要意义。同时，宿主基因多态性与结核病易感性一直是人们感兴趣的研究方向，阐明其相关性及其机制对于预防控制结核病以及解释我国结核病高疫情是很有意义的工作。2016年我国结核病研究人员在这两个领域进行了有益的探索并取得了初步结果，为进一步深入研究奠定了基础。
关键词： 结核病；基因分型；耐药菌株；耐药基因
我国仍然属于结核病高负担国家，结核病、耐药结核病的流行状况不容乐观。近1年来，结核病分子流行病学方面的研究取得了一定的进展，现简要总结如下。
喻容等 ［1］ 分析了长沙耐多药结核分枝杆菌（MDR-TB）菌株对抗结核药物的敏感性。该研究采用绝对浓度法检测了2014年长沙市155株耐多药结核分枝杆菌临床分离株对一二线抗结核药物的耐药性，回顾性分析其耐药情况。结果发现155株耐多药结核分枝杆菌对一二线抗结核药物耐药率从高到低为：链霉素（S）>乙胺丁醇（E）>左氧氟沙星（OFL）>对氨基水杨酸钠（PAS）>丙硫异酰胺（TH）>卡那霉素（K）=吡嗪酰胺（PZA），耐药率依次为：70.32%、36.13%、20.65%、12.90%、8.39%、3.87%、3.87%。耐两种药的耐药株达46株，其中以链霉素与乙胺丁醇为主，其耐药率达29.68%；耐三种药的耐药株达18株，其中以链霉素、乙胺丁醇与左氧氟沙星为主，其耐药率达11.61%；耐四种药的耐药株有5株，其中以链霉素、乙胺丁醇、左氧氟沙星及丙硫异酰胺为主，耐药率为3.23%；耐五种药和六种药的各有1株和2株。结果说明长沙市MDR-TB对一线甚至二线抗结核药耐药严重，为MDR-TB防治带来巨大挑战。
一项由包海洋等 ［2］ 进行的研究对北疆地区结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型和耐药性检测，旨在探究不同基因型在该地区的流行及耐药性。该研究收集北疆地区114株结核分枝杆菌临床分离株，采用间隔区寡核苷酸和多位点可变串联重复序列（VNTR）技术进行基因分型，使用比例法检测临床分离株的耐药性。结果发现，114株临床分离株，间隔区寡核苷酸分型结果和RDl05缺失检测法结果显示北京基因型占62.28%（71/114）、非北京基因型占37.72%（43/114）。菌株可以分2大簇（A和B）：A簇有34株，北京基因型占11.77%（4/34），非北京基因型占88.23%（30/34）；B簇有80株，北京基因型占83.75%（67/80），非北京基因型占16.25%（13/80）。耐药情况显示：总耐药率为40.35%（46/114），耐多药（MDR）率为19.30%（22/114）；北京基因型耐药率为42.25%（30/71），非北京基因型的耐药率为37.21%（16/43），差异无统计学意义（χ 2 =0.28， P =0.60）。其中，北京基因型MDR耐药菌株占22.54%（16/71）。该研究表明，北疆地区北京基因型和非北京基因型的耐药率没有差异，但MDR菌株流行主要是由北京基因型引起的。
胡族琼等 ［3］ 探究了结核分枝杆菌rpoB基因突变特征与利福平耐药水平的关系。该研究测定了266株（109株利福平耐药株，157株利福平敏感株）结核分枝杆菌利福平最小抑菌浓度（MIC值）及其rpoB基因序列，并分析不同突变特征的菌株其利福平MIC值的差异。结果发现：109株利福平耐药株rpoB基因皆发生错义突变，常见突变密码子531与526的突变频率分别为69.7%与17.4%；利福平耐药株中单密码子突变株占82.6%，多重密码子突变株占17.4%；531单密码子突变株与526单密码子突变株之间平均利福平MIC值差异无统计学意义（ P =0.87），但两独立样本 T 检验分析显示，多重密码子突变株平均利福平MIC值（115.8μg/ml）显著高于单密码子突变株，平均利福平MIC值48.4μg/ml（ t =2.659， P =0.016）；利福平敏感株未发生错义突变；5.5%（6/109）的利福平耐药株仅在rpoB基因起始端发生突变，突变密码子分别是247、251和253。结果表明：531与526单密码子突变株之间利福平耐药水平差异无统计学意义，但多重密码子突变株利福平耐药水平显著高于单密码子突变株利福平耐药水平；rpoB基因起始端突变可能是除利福平耐药决定区域之外导致利福平耐药的第2个耐药决定区；rpoB基因DNA序列分析有助于对结核分枝杆菌利福平耐药表型和耐药水平的预测。
一项由孟庆琳等 ［4］ 进行的研究分析了耐多药结核分枝杆菌不同基因型构成以及耐药相关基因突变特征。该研究从2007年全国耐药基线调查共收集的结核分枝杆菌临床分离株4017株中，经比例法药物敏感性试验鉴定纳入376株耐多药菌株进行分析；采用RDl05缺失基因检测法鉴定北京基因型菌株和非北京基因型菌株；并对所有耐多药菌株利福平耐药相关基因（rpoB）和异烟肼耐药相关基因（katG，inhA和oxyR-ahpC）进行测序，分析耐药相关基因突变的特征。结果发现，在376株耐多药菌株中，有261株（69.4%，261/376）属于北京基因型，其余115株（30.6%，115/376）属于非北京基因型。北京基因型菌株中氧氟沙星耐药率（31.8%，83/261）和前广泛耐药率（30.7%，80/261）明显高于非北京基因型菌株的氧氟沙星耐药率（17.4%，20/115）和前广泛耐药率（15.7%，18/115），差异均有统计学意义（χ 2 值分别为8.33和9.32， P 值均<0.05）。比较北京基因型菌株和非北京基因型菌株不同位点的突变频率，发现北京基因型菌株rpoB基因第531位点（67.4%，176/261）和katG基因（66.3%，173/261）的突变频率明显高于非北京基因型（rpoB：54.1%，62/115，χ 2 =6.28， P =0.010；katG：50.4%，58/115，χ 2 =8.46， P =0.000），而非北京基因型菌株未发生rpoB基因突变的菌株比例（14.8%，17/115）明显高于北京基因型菌株（1.1%，3/261），差异有统计学意义（χ 2 =29.46， P =0.000）。结果表明，北京基因型耐多药菌株与氧氟沙星耐药高度相关，与非北京基因型耐多药菌株相比，rpoB基因的第531位点和katG基因突变更多发生于北京基因型菌株中。
liu等 ［5］ 探究了结核分枝杆菌现代北京家族株的遗传特征。该研究通过分析已发表的1082份结核分枝杆菌北京家族株的测序数据，发现了现代型北京家族株中存在而古老型北京家族株中未发生的遗传变异，包括44个SNP和2个短基因片段的缺失。通过生物信息学的分析，发现这些基因的改变很可能影响了细菌的功能：4个基因由于提前终止突变或者基因片段缺失发生了移码突变，19个非同义SNP突变发生在保守密码子区域，并且在所有非同义突变的调控网中，这些突变出现了显著富集的现象；此外，3个位于启动子区域的SNP突变已被证实会改变下游的基因表达。该研究准确定义了现代北京家族菌株的遗传特征，并且为进一步关于该型菌株成功扩张的相关机制研究提供了有趣的线索。
世界上有1/3人口曾感染了结核分枝杆菌，但是只有少数感染者发展成活动性结核病，这表明结核病存在易感人群及易感性。研究发现基因多态性会影响机体对结核分枝杆菌的免疫力，造成机体对结核病易感性发生改变，对疾病的发生和发展产生影响。我国学者对宿主基因多态性与易感性的关系进行了有益的探索，为进一步研究提供了基础。
刘洋等 ［6］ 对142例肺结核患者和120例健康对照者血清中甘露糖结合凝集素（MBL）水平进行测定，同时采用限制性片段长度多态性分析方法对MBL2基因多态性进行测定，研究MBL水平的调节与结核病易感性的关系。结果表明3组不同基因型的MBL水平均有差异，肺结核患者MBL水平要高于健康对照组。该研究表明高水平MBL与结核病易感性显著相关；启动子‐221（Y/X）和外显子1密码子54（A/B）MBL基因突变与肺结核易感性有关；而决定高水平的YA/YA基因可能对肺结核病发生起到保护作用。
王慧琳等 ［7］ 使用竞争性等位基因特异性PCR方法检测了494例肺结核患者以及413名健康志愿者静脉血中CCL5启动子区rs2107538和CCR5启动子区rs1799987基因型，计算病例组和对照组基因型及等位基因频率，并对其分布情况进行比较，分析各基因多态性与肺结核病的相关性。结果显示CCL5启动子区rs2107538基因多态性与肺结核病无相关性；而携带CCR5启动子区rs1799987基因-2459位点基因型GG和等位基因G可降低非结核病的患病风险。
谭国超等 ［8］ 对147例肺结核患者及206例健康个体中白介素-10（IL-10）基因-819（C>T）、-1082（A>G）多态位点基因型进行关联分析，探讨IL-10基因单核苷酸多态性与肺结核易感性的相关性。结果显示-1082多态位点AA、AG、GG基因型在病例组中的分布频率分别为48.6%、43.2%和8.2%，而在对照组中分别为60.5%、36.1%和3.4%，二者之间存在统计学差异（ P =0.032），G为风险等位基因（OR=1.55，95%CI：1.10～2.19）。IL-10基因-1082（A>G）位点单核苷酸多态性与我国西部汉族人群患肺结核的风险升高显著相关，提示可作为该地区肺结核早期预警筛查的候选分子标志物。
江道斌等 ［9］ 选取250例活动性肺结核患者和250名正常对照，采用配对病例对照关联研究设计方法，应用Taqman实时定量PCR检测白介素-23受体（IL-23R）基因第11外显子的基因拷贝数，分析拷贝数变异与新疆维吾尔族人群结核病易感性的相关性。结果显示IL-23R基因第11外显子的拷贝数变异与新疆维吾尔族人群肺结核的易感性相关，该位点拷贝数的增加可能是新疆维吾尔族人群肺结核发生的风险因素。
王骑凤等 ［10］ 采用短串联重复PCR扩增结合毛细管电泳方法检FAM46A基因VNTR位点多态性，并且使用PCR-RFLP方法检测EBFl基因rsl0515787位点多态性。发现在河南汉族人群中FAM46A基因VNTR位点存在4种等位基因、9种基因型；EBFl基因rsl0515787位点存在2种等位基因、3种基因型（AA、GG、AG）。该研究结果显示，EBF1基因rs10515787位点多态性与肺结核的易感性有关，且AA基因型及A等位基因可能是河南汉族肺结核发生的危险因子。
黄长江等 ［11］ 运用meta分析方法分析干扰素-γ（INF-γ）基因+874位点基因多态性与肺结核易感性的关系。该研究通过计算机检索数据库发表的有关INF-γ基因+874位点基因多态性与肺结核易感性的中英文献，共纳入21项研究，患者3798例，对照组4608例。该研究提示INF-γ基因+874 T/A基因多态性与亚洲人肺结核的易感性相关，在亚洲人群AA基因型是肺结核的易感基因型。
（李霞 刘晓帆 王川 高谦）
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摘要： 结核分枝杆菌耐药性的出现及其在全球和我国不断加剧的趋势为结核病的预防和控制带来了严峻的挑战。同时疫苗和抗结核药物尤其是新药的开发严重滞后，导致我国目前治疗结核病的药物仍然是传统的一线抗结核药物和二线抗结核药物。虽然目前有部分抗结核新药已在国外上市，WHO也推荐了新的药物治疗方案来治疗敏感结核病和耐药结核病，但是这种更新的速度是远远不够的。因此对抗结核新药和药物靶点的研发需求显得愈加迫切，2016年国内的研究者们在抗结核新药和新药靶点的研究中取得了一定的进展和成果，发现一些抗结核候选新药和药物靶点。另外，对药物和宿主免疫系统本身的相互作用及中药在抗结核病方面也有一些研究和新的发现，现对其进行概括和综述。
关键词： 抗结核药物；药物靶点；中药；免疫调节
2016年国内的抗结核药物和药物靶点研究进展，有亮点也有不足。对现有药物的作用机制和创新组合用药开展了研究工作，同时在新的药物靶点的研究中也有新的发现，对传统中药的抗结核和免疫调节作用继续开展研究工作，这对于临床治疗和结核病的预防控制都具有一定的指导意义，并由此发现了后续很多值得推进和重点关注的研究领域。
1.利福平耐药菌株ropB基因不同突变位点变化对临床的指导意义
结核分枝杆菌rpoB突变株中突变位点分别为531（C-T）、526（C-G/T）和516（A-G/T）。研究表明531（C-T）位点突变株的MIC值为（576.0±29.3）µg/ml，均高于516（A-G/T）的（432.9±38.2）µg/ml和526（C-G/T）的（355.5±59.5）µg/ml（ P <0.05），基因芯片检测结核分枝杆菌rpoB基因突变株，结果发现基因突变与其耐药表型相关性较高，不同突变位点的结核杆分枝菌株对利福平的耐药程度有差异，这说明研究其基因突变位点可以为临床合理用药提供重要参考 ［1］ 。
2.药物通过对宿主免疫系统的影响来施加作用
地塞米松在使用过程中会对结核性脑膜炎患者单核细胞TLR4/MyD88的信号通路表达产生影响。Toll样受体是固有免疫中一种重要的识别受体，其中TLR4分布于抗原递呈细胞，TLR4可以通过下游MyD88依赖途径进行信号传导。地塞米松对其会产生双向调节作用：可以诱导静息状态下的T细胞高表达TLR4，却抑制活化后T细胞的TLR4表达。周杰等 ［2］ 研究表明抗结核治疗时联合使用地塞米松能显著提高治疗有效率，可能和TLR4-MyD88的信号传递通路的重要调节作用有关，显示地塞米松治疗结核性脑膜炎过程中可以发挥重要作用。另外袁秀丽等 ［3］ 的研究表明苦参提取物在对耐多药结核分枝杆菌（MDR-TB）的治疗有重要作用，动物实验表明感染小鼠后，在小鼠实验模型中显示了重要的免疫功能调节作用，其可以同时提升MDR-TB感染小鼠的细胞免疫及体液免疫水平，具有明显的抗MDR-TB作用。另外，远高 ［4］ 研究发现人工合成的多肽类药物-胸腺肽具有调节人体免疫功能的作用，在应用于复治涂阳肺结核患者的治疗中发现，胸腺肽能持续性刺激患者的前T淋巴细胞，使其不断重复分化、成熟这一过程，刺激人体产生和释放多种淋巴因子，可有效增强患者自身体质的免疫力及抵抗力，达到有效抑制肺结核患者感染、缓解感染症状的目的。
1.针对吲哚-3-甘油磷酸合成酶结构类似物的研究
周涛等 ［5］ 研究发现，通过同源建模方法，模拟结核分枝杆菌H37Rv来源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶（IGPS）的结构，从化合物库中筛选能与IGPS有效结合的化合物，发现ATB26能与IGPS很好结合，并能在体外有效抑制H37Rv和临床分离的敏感和耐药菌株的生长，表明化合物ATB26是一个新型IGPS抑制剂，有望开发成为新型的抗结核药，也可作为新型抗结核药物开发的一个潜在靶点。
2.结核分枝杆菌Rv3194c蛋白的研究
赵东岳等 ［6］ 研究发现Rv3194c基因编码的是结核分枝杆菌的PDZ信号蛋白，含有PDZ结构域，PDZ结构域由3部分构成：PSD-95（post-synapticdensity-95），DLG（drosophilia tumor suppressorprotein diskslarge-1），ZO-1（the tight junction proteinzonula occludentes 1），富含PDZ结构域的蛋白通常是蛋白相互作用的“节点”。研究证实Rv3194c蛋白具有该结构域，该结构域功能的特殊性使其成为下一代药物的理想靶标；而且研究证实Rv3194c蛋白具有黏附素特性，其与透明质酸、硫酸软骨素和Ⅰ型胶原蛋白均有相互作用，很有可能作为研发新型抗结核药物的靶点蛋白。
3.生物素抗结核作用的研究进展
THOMPSON等 ［7］ 研究发现微生物合成生物素的过程中有可能会发现新的药物靶标，如生物素蛋白连接酶及其相关产物，这些都是合成通路中必不可少的关键分子；结核分枝杆菌需要由菌体进行生物素的全程合成，以维持其正常的功能和作用机制，合成过程中必须要通过生物素蛋白连接酶连接活性辅助因子而被激活。因此，生物素合成酶在结核杆菌代谢过程中起着至关重要的作用，对其的研究开发有可能成为新的抗结核药物靶点。
除了以上的研究工作，国内科学家通过抗菌药物的再修饰、天然产物筛选以及全新结构化合物的设计合成等工作，得到了20～30种结构类型的抗结核化合物，其中有部分新颖结构，并发现了一些具有前景的药物候选物。其中异烟肼类似物研究有优于异烟肼的表现；另外对贝达喹啉类似物、新喹啉嘧啶衍生物的研究也有不少进展；对乙胺丁醇衍生物的模拟研究发现可以提高药物的活性，对敏感菌和MDR-TB的疗效均有不同程度的提高 ［8］ 。
1.中药联合抗结核药物治疗提高疗效
姬粉芝 ［9］ 报道了百令胶囊联合抗结核药物治疗肺结核的情况，肺结核患者均接受2HRZE/4HR抗结核方案的治疗方法，联合使用百令胶囊治疗，结果研究组肺结核吸收情况优于对照组，（明显吸收53.3%，吸收3.3%，无变化13.3%），百令胶囊联合抗结核药物治疗肺结核的疗效好，有一定的临床应用价值。王谦信等 ［10］ 报道，用参麦地黄丸联合抗结核药物治疗肺结核合并糖尿病，取得良好的疗效，故建议对肺结核合并糖尿病在选择抗结核药物治疗和积极治疗糖尿病的同时，加服参麦地黄丸，以提高疗效。
2.中药对肝肾损伤结核患者的保护作用
楼俞等 ［11］ 报道，白藜芦醇对抗结核药物致大鼠肝损伤中有保护作用，可显著改善血清肝生化指标，降低MDA（丙二醛）含量，增加SOD（超氧化物歧化酶）活性，改善大鼠肝损伤，这可能与其激活SIRT1（沉默信息调节因子1）、减轻氧化应激及抑制CHOP（增强子结合蛋白同源蛋白）的表达有关。张玲等 ［12］ 报道了五酯片在肾移植术后含利福平抗结核治疗中的应用，五酯片作为肾移植术后抗结核治疗的辅助用药，既能保证含利福平的标准治疗方案的疗效，又能维持血他克莫司浓度稳定，降低急性排斥反应发生风险，并大幅减少他克莫司用量。
近一年国内的抗结核药物和药物靶点研究取得了长足进展，有亮点也有不足，后续还有很多值得推进和重点关注的研究领域。虽然已有新发现的抗结核药物作用机制以及候选药物靶点，对于临床治疗和用药具有一定的指导意义，但距离开发成新药，成功的应用于临床治疗结核病还任重道远。实践也证明了传统中药在调节人体免疫力对抗结核病中具有很好的作用和前景，因此未来的抗结核药物和药物靶点研究中应该给予重点关注。相信随着新靶点及新药物的研发，传统药物的优化以及从中药中寻求抗结核药物和免疫调节药物的使用，对结核病的预防和控制能力将会逐渐加强，尤其对临床治疗效果的提高更加会有促进作用。
（刘毅 李传友）
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摘要： 既往数据显示，2015年的全球新发结核病人数1040万，死亡人数140万，与上一年度相比发病数和死亡数都有所上升。结核病发病和死亡人数的增多使得对于结核病疫苗，特别是效力更好的结核病疫苗的需求更加迫切。目前共有13个结核病疫苗正在进行临床试验，其中有4个病毒载体疫苗（Ad5Ag85A、ChAdOx1.85、MVA85A、TB/TLU-04L），4个重组亚单位疫苗（H1/H56、H4、ID93、M72），2个非结核分枝杆菌疫苗（DAR-901、Vaccae），1个重组结核分枝杆菌疫苗（MTBVAC），1个重组BCG疫苗（VPM1002），1个结核分枝杆菌提取物疫苗（RUTI）。然而临床期的疫苗能否达到预期的保护效力仍有很大的不确定性。随着新的生物学技术的出现，将来会有越来越多的新免疫原被发现，而从中选择最优的免疫原或免疫原组合，并基于这些免疫原及时开发新的结核病疫苗，并尽快完成临床前研究至临床试验评估，才能更好地满足目前临床需求。通过不断推出新的候选结核病疫苗，有望加快结核病疫苗的开发进程，早日实现通过疫苗控制结核病的目标。
关键词： 结核病疫苗；重组亚单位疫苗；BCG；安全性；效力；免疫原
2016年我国科研工作者主要评估了重组亚单位疫苗WH121/DMT、AEC/BC02，重组BCG疫苗rBCG-BE1726D、微卡疫苗的安全性和效力，并系统性地评估了不同遗传谱系的BCG菌株疫苗毒力及效力，以及对结核病疫苗新抗原靶标Rv3400进行了研究和探讨。
具有疫苗潜力的结核分枝杆菌保护性抗原仍然是研究重点。Ma等 ［1］ 选择5个结核菌不同阶段特征性表达的蛋白（Ag85A、PhoY2、Rv3407、Rv2626c、RpfB）构建了融合蛋白，并制备了亚单位疫苗WH121/DMT。WH121/DMT疫苗组与各单组分抗原疫苗组相比具有更好免疫原性和保护力。WH121/DMT疫苗接种C57BL/6小鼠在免疫9周和18周后，每只小鼠80个CFU的毒性结核分枝杆菌H37Rv感染，WH121/DM疫苗组与BCG保护力相当（肺脾组织载菌量及肺组织病变水平相当）。小鼠BCG免疫后用结核菌感染，再次用WH121/DMT和BCG分别免疫，WH121比BCG重复接种更能显著地抑制脾中结核菌的生长，甚至有4/6的小鼠脾中没有检测结核菌。WH121/DMT引起的保护主要由于WH121特异性Th1型免疫应答，包括高水平的抗原特异性IgG2a/IgG1比值和高水平的IFN-g。这些研究结果表明多级特异性抗原可能是下一代结核疫苗的希望，但这些抗原组合的疫苗仍需要进一步临床前评估。
脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗原是一种存在于结核杆菌细胞壁上的脂多糖，它能从代谢活跃或老化的结核分枝杆菌中释放出来并且仅存在于活动性结核病人体内。Sun等 ［2］ 阐述了单一ssDNA适配体结合到BCG上甘露糖包被的脂阿拉伯甘露聚糖后，增强了抗结核的免疫保护作用。文章选择特异性结合BCG的甘露糖包被的脂阿拉伯甘露聚糖（ManLAM）的ssDNA适配体“抗体”BM2，利用BM2显著阻断ManLAM-甘露糖受体（MR）结合，触发ManLAM-CD44信号传导，并在体外和体内通过细胞表面CD44增强M1巨噬细胞和Th1活化。BM2增强小鼠和猴模型中BCG对毒性结核分枝杆菌H37Rv感染的免疫保护作用。报告了ManLAM和CD44在巨噬细胞和CD4 + T细胞之间相互作用的新机制，并揭示与ManLAM结合的膜分子CD44是增强BCG免疫原性的新靶标，并且BM2具有作为BCG免疫增强剂的潜力。
重组结核疫苗AEC/BC02作为潜伏性结核感染（LTBI）人群的候选疫苗，由结核分枝杆菌抗原Ag85B、ESAT6-CFP10和复合佐剂BC02构成。卢锦标等 ［3］ 对结核分枝杆菌感染豚鼠接种重组结核疫苗AEC/BC02后的超敏反应（Koch现象）进行研究，通过脏器病变和细菌载量分析、肺部炎症评估，结果显示，与接种H37Ra灭活全菌体后可产生较为明显的超敏反应相比，重组结核疫苗AEC/BC02诱发超敏反应的风险较低。豚鼠感染结核分枝杆菌（5.0×10 3 CFU/只），40天后平均分成3组，每组6只，分别经AEC/BC02疫苗和H37Ra菌体免疫3针，肝、脾、肺脏器的病变程度均有所减轻，其中H37Ra组综合评分（48±26）低于生理盐水组（62±15），差异无统计学意义。AEC/BC02组（36±15）与生理盐水组比较，差异有统计学意义。AEC/BC02组与H37Ra组比差异无统计学意义。尽管AEC/BC02疫苗组脏器综合病变程度较轻，但脾和肺脏的活菌计数结果显示，仅脾活菌数［（4.64±0.64）log10CFU］低于生理盐水组［（5.57±0.75）log10CFU］，差异有统计学意义，而两组肺活菌数比较差异无统计学意义；同时H37Ra组脾和肺的细菌载量也低于生理盐水组，但差异无统计学意义。AEC/BC02疫苗连续3针次免疫后没有观察到明显的超敏反应，HE染色呈弥散的炎症反应，肺部结构大体完整，炎症区域为18%而H37Ra组为33.6%。肺部炎症反应提示感染结核分枝杆菌的豚鼠接种H37Ra灭活全菌体后可产生较为明显的Koch反应，而重组AEC/BC02疫苗诱发Koch现象的风险较低，提示AEC/BC02疫苗对LTBI人群诱发超敏反应的风险较低。
李军丽等 ［4］ 克隆表达并纯化了结核分枝杆菌多表位融合蛋白TP15，分别以MF59和hBCG单独或联合作为佐剂，并通过皮下或肌内注射BALB/c小鼠，采用间接ELISA法检测小鼠血清抗TP15特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体，流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞多功能CD4 + T细胞含量，夹心ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中的细胞因子IL-1β和IL-12的含量，分析了不同佐剂和免疫途径对TP15免疫原性的影响。结果显示MF59和hBCG单独或联合作为TP15抗原的佐剂，其免疫原性存在一定差异，但均优于无佐剂TP15。MF59+hBCG复合佐剂增强TP15抗原免疫反应的效果优于单一佐剂，诱导Th1型细胞免疫漂移，且皮下注射免疫效果优于肌内注射。
美国Aeras通过基因重组技术将5种结核杆菌免疫保护相关抗原Ag85B、ESAT-6、Rv1733c、Rv2626c和RpfD导入亲本株BCG中，构成rBCG-BE1726D。rBCG-BE1726D可表达Ag85B、ESAT-6、Rv262c三种蛋白，BCG-SSI菌株未检测ESAT-6、Rv262c抗原表达。张海峰等 ［5］ 鉴定rBCG-BE1726D特异性蛋白的表达，并初步评价其在小鼠体内的免疫原性。通过皮下免疫BALB/c小鼠，分离脾淋巴细胞，ELISPOT及ELISA法检测IFN-γ的分泌水平高于BCG，但无统计学意义；流式细胞术检测CD4 + 、CD8 + T细胞的比例，明显高于BCG组。结果表明rBCG-BE1726D免疫小鼠后可能以激活CD8 + T细胞为主。rBCG-BE1726D菌株中分泌IFN-γ的淋巴细胞虽然高于BCG菌株，但无显著差异。因此，rBCG-BE1726D需要进一步证实其免疫原性。疫苗的最终保护效果必须依赖动物模型的攻毒保护性实验进行评价，所以，rBCG-BE1726D的实际保护力仍有待进一步研究。
母牛分枝杆菌菌苗微卡（M.vaccae）是目前唯一进入临床Ⅲ期的候选疫苗，由安徽龙科马生物制药有限公司研发。郭存炳 ［6］ 通过对微卡治疗患者血清血管活性肠肽（VIP）、IL-17水平比较，分析发现微卡肌注治疗能明显降低耐多药性肺结核患者血清VIP、IL-17水平，具有很好的临床疗效。夏露等 ［7］ 通过比较抗结核治疗组和微卡组患儿的治疗效果和不良反应，评价微卡在治疗卡介苗反应性淋巴结炎的临床效果。结果表明，抗结核治疗组100%（25/25）患儿淋巴结肿大均逐渐消退，微卡组95.5%（42/44）淋巴结肿大逐渐消退，两组有效率比较差异无统计学意义。抗结核药物治疗组16%（4/25）出现肝功能损伤，微卡组无患儿出现肝功能损伤，两组肝损伤发生率比较差异有统计学意义。采用微卡治疗卡介苗反应性淋巴结炎具有较好的效果，且可减少患儿不良反应的发生。该研究为治疗卡介苗反应性淋巴结炎提供参考依据。高德杰等 ［8］ 通过分析微卡在预防性治疗LTBI中的细胞免疫学作用机制，随机选取2014年4月至2015年4月收治的LTBI患者120例，依据整群随机抽样的方法将患者分为微卡治疗组、化学治疗组和对照组，各40例，比对3组患者细胞免疫学指标水平变化。治疗后1个月微卡治疗组患者的CD3 + CD4 + 、CD3 + CD56 + 均显著高于对照组，化学治疗组患者的CD4 + IFN-γ + 显著高于对照组。表明，微卡对于LTBI有预防性免疫治疗作用。
朱琳等 ［9］ 克隆表达并纯化了结核亚单位疫苗Rv3400-IFA，结核亚单位疫苗Rv3400-IFA是一种由结核分枝杆菌抗原Rv3400联合弗氏不完全佐剂（incomplete Freund’s asjuvant，IFA）构成的新型疫苗；并且在C57BL/6小鼠体内评估Rv3400的免疫效应；在体外用抗原Rv3400感染巨噬细胞RAW264.7，每组5只，每2周1次，共免疫3次，评估其免疫应答，其中阴性对照为未刺激的巨噬细胞。结果显示，Rv3400-IFA免疫小鼠后，可产生较好的细胞免疫和体液免疫效应，以诱导小鼠持久Thl型免疫反应为主；体外细胞实验结果显示Rv3400抗原能促进细胞分泌高水平的IL-6和TNF-α，分别达到（49 217.0±390.61）pg/ml、（1783.4±51.18）pg/ml；阳性细胞比率分别由未刺激的（34.704±2.40）%、（31.254±18.31）%、（41.804±6.01）%和（44.30±0.44）%提高至1μg/ml Rv3400抗原刺激后的（90.45±7.71）%、（90.104±4.10）%、（89.97±7.79）%和（85.134±5.12）%，增加巨噬细胞表面分子CD40、CD80、CD86、MHCⅡ的表达，引发较强的免疫反应。免疫小鼠后，ELISPOT结果显示：实验组Rv3400组小鼠分泌IFN-γ的斑点形成细胞（136.20±95.09）显著高于阴性对照组（14.00±9.62），ELISA结果同样显示Rv3400组小鼠T细胞产生TNF-α和IFN-γ的水平明显高于阴性对照组。通过间接ELISA测定免疫后的小鼠血清抗体IgG效价水平高达1∶409 600，表明抗原Rv3400也能诱导有效的体液免疫应答；IgG2b/IgGl水平为1.8，说明抗原Rv3400诱导小鼠以Thl型免疫反应为主。Rv3400有望成为结核疫苗的候选抗原。
BCG从1924年在世界范围内开始推广使用，至今已经有超过40亿人接种。目前BCG是全球最为广泛使用的疫苗，每年接种剂量超过1.2亿剂。然而由于早期菌株保藏及传代不规范，使得不同国家使用的BCG菌株存在遗传因子和生化表型上的差异，不再是1921年时单一的菌株。世界范围内使用的十几株BCG菌株根据DU2遗传特点可以分为DU2Ⅰ、DU2Ⅱ、DU2Ⅲ、DU2Ⅳ四个遗传谱系。不同BCG菌株疫苗在不同国家或地区中的保护效果存在较大差异。
Zhang等 ［10］ 将4个遗传谱系（DU2Ⅰ～Ⅳ）的13株BCG通过动物模型进行了系统的安全性和效力评估。13株BCG在重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠中的安全性实验（每只小鼠按10 7 CFU BCG尾静脉感染，观察18周）结果表明，DU2Ⅳ组的BCG-Phipps、BCG-Frappier、BCG-Pasteur和BCG-Tice的毒力最高，SCID小鼠生存时间在10周左右，分别为48、53.5、55、58天；肺组织载菌量在接种后4周分别达到7.35log10、7.34log10、6.76log10、7.11log10，与接种后1周相比平均上升了2.5log10。BCG-China、BCG-Moreau、BCG-Russia和BCG-Danish的毒力水平中等，生存时间分别达到83、94.5、99.5、114天；肺组织载菌量在接种后4周与1周相比上升了1.2log10～2.1log10。BCG-Japan、BCG-Birkhaug、BCG-Sweden、BCG-Glaxo和BCGPrague的毒力最弱，在18周内生存率分别为93.75%、100%、100%、100%和100%；肺组织载菌量在接种后4周与1周相比平均仅上升了0.2log10。BCG-Pasteur、BCG-Russia菌株重复实验时，SCID小鼠生存时间分别达到了42、84天；BCG-Japan株18周结束时小鼠全部存活，与第一次实验结果一致。
13株BCG在BALB/c小鼠中的效力评估（每只小鼠按10 6 CFU BCG皮下免疫，免疫后8周用100CFU H37Rv气溶胶感染，感染后4周、9周解剖检测）结果表明，感染后4周：BCG-Phipps、BCG-Frappier、BCG-Pasteur、BCG-Tice、BCG-Danish、BCG-Prague、BCG-Russia和BCG-Moreau免疫组与对照组相比肺组织载菌量下降显著，达到0.58log10～1.03log10；BCGChina、BCG-Glaxo、BCG-Japan、BCG-Birkhaug和BCG-Sweden免疫组肺组织载菌量下降与对照组相比无显著差异。BCG-Pasteur、BCG-Tice和BCG-Danish免疫组脾组织载菌量平均下降0.78log10，与对照组相比下降差异显著，其余BCG菌株脾组织载菌量下降与对照组相比无显著差异。感染后9周：13株BCG免疫组肺、脾平均载菌量为6.77log10和6.07log10与对照组肺载菌量6.65log10和脾载菌量5.89log10相比均无显著差异。综合安全性和效力实验结果发现，BCG菌株毒性与其保护效果存在相关性，显示出BCG菌株毒性越强保护性越好的趋势。本研究结果对于世界范围内如何选择最优的BCG菌株作为生产用疫苗菌株以及开发新的重组BCG疫苗时如何选择BCG母体菌株提供了重要的数据参考。
从细菌菌体中直接提取Ag85A蛋白易发生凝聚和降解且难以纯化。而对Ag85A进行原核表达及相关研究多以包涵体形式表达，因此限制了Ag85A的应用。徐正中等 ［11］ 利用冷休克表达质粒和含有伴侣质粒的大肠杆菌对Ag85A蛋白进行可溶性表达并纯化鉴定，通过C57BL/6小鼠模型对Ag85A蛋白的免疫原性进行分析，该蛋白具有较好的免疫反应性。从而为其进一步免疫功能的研究及其应用奠定了基础。
应用分子生物学技术，王森林等 ［12］ 将结核分枝杆菌抗原Hsp65、Esat6和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子hGM-CSF融合，构建plHsp65-Esat6GM共表达质粒，并在真核细胞HepG-2中表达。结核分枝杆菌热休克蛋白X（HspX）是第一个被证实在营养不足、缺氧状态和休眠期时表达的参与潜伏感染的蛋白，是维持其在巨噬细胞内生存的必需蛋白。张继明等 ［13］ 构建HspX基因与EGFP融合基因的真核表达质粒pEGFP-N1-HspX，并在小鼠单核巨噬细胞RAW264.7中表达。王君等 ［14］ 利用融合PCR技术，将PhoP、PhoR和PhoPR基因上、下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合，构建PhoP、PhoR和PhoPR突变片段，进而获得了结核分枝杆菌PhoPR双组分系统缺失突变载体，与传统方法相比，效率高、周期短。这些均为研制新型结核疫苗奠定了基础。
体内定植性是活菌疫苗研发必备的条件之一，柳小玲等 ［15］ 观察了融合菌株B/R的生长特性及其在免疫小鼠体内的生长情况。B/R菌株由其实验室前期构建，融合了BCG和H37Ra菌株。结果显示与单独BCG或H37Ra相比，B/R菌株的定植能力较强，生长周期为30天，在小鼠体内至少存活2个月。这对B/R菌株作为结核候选疫苗具有参考作用，为研制新型结核疫苗奠定了基础。
（王雅果 毕利军）
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摘要： 结核分枝杆菌为结核病的病原菌，深入了解结核分枝杆菌的生理生化特性，是预防控制结核病的基础。近一年来，国内学者在结核分枝杆菌抗原的免疫原性及抗原表位、毒力因子、持留以及耐药等方面取得了不少研究成果。
关键词： 结核分枝杆菌；免疫原性；抗原表位；毒力因子；持留感染；耐药
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）为缓慢生长菌，有分枝生长的倾向，由于细胞壁内含有大量的分枝菌酸，包围在肽聚糖的外面，而具有抗酸染色特性。Mtb生理生化的特殊性，不仅使其在自然环境中具有较强的抵抗力，如在阴湿处能生存5个月以上；Mtb还能通过多种逃逸机制而抵抗宿主细胞的杀伤。由此可见，深入研究Mtb的生理生化特性，能为更好地理解结核病的发病机制和结核病的防控提供有利的基础。
Mtb生长早中期分泌到胞外的一类蛋白质称为分泌性蛋白，具有高度免疫原性和特异性，对分泌性蛋白研究较深入的是Esx-1分泌系中的6kD早期分泌抗原（ESAT-6）和早期滤液蛋白-10（CFP-10）。Esx-1底物蛋白Rv3615c是含有103个氨基酸的ESAT-6样蛋白，其N-末端的20个氨基酸在ESAT-6家族成员中相对保守，BLAST比对显示其序列与ESAT-6、CFP-10高度相似。为探究Rv3615c的免疫原性，许礼发等 ［1］ 成功构建结核分枝杆菌Esx-1底物蛋白Rv3615c的原核表达质粒pET30b-Rv3615c。利用全血IFN-γ分析试验（WBIA）检测Rv3615c蛋白特异性刺激淮南市Mtb感染者淋巴细胞，发现IFN-γ浓度显著高于健康对照者。Rv3615c/SAS诱导小鼠产生的IgG、IgG1、IgG2a以及Rv3615/SAS诱导小鼠脾淋巴细胞分泌的特异性IFN-γ、TNF-α和IL-2，均显著高于PBS组和SAS组，显示rRv3615c具有较强的免疫原性，可诱导趋向于Th1型免疫应答。
Rv2660c编码的蛋白通过识别TLR2可激活巨噬细胞，从而刺激机体分泌IL-1β、IL-8、TNF-α和IL-12p70等促炎症因子，这些因子对肉芽肿的形成有重要作用，此外Rv2660c蛋白还能激活潜伏性感染结核者的细胞免疫和体液免疫，而关于Rv2660c蛋白应用于抗潜伏期结核的相关报道较少，缺乏Rv2660c蛋白的结构和免疫学特性的基础资料。蒋明娟等 ［2］ 通过BLAST软件分析，发现Rv2660c蛋白与人类蛋白同源性不高，同源性最高的人类蛋白是MAD6蛋白，同源性仅为16%。进一步采用生物信息学方法预测，发现Rv2660c蛋白无跨膜区，为胞外蛋白，不含信号肽序列。此外，Rv2660c还含有丰富的B细胞和T细胞抗原表位，其中19-35、48-54、28-44和58-73位氨基酸残基可能存在优势线性B细胞表位；56-64和65-74位氨基酸可能存在优势辅助性T细胞表位，66-74、41-49、63-71位氨基酸可能存在优势细胞毒性T细胞表位，这些丰富抗原表位，有望作为潜伏性感染结核的治疗性疫苗和药物的作用靶点。
TB10.4又名culture filtrate protein-7（CFP-7），由结核分枝杆菌EsxH（Rv0288）基因编码表达。关于TB10.4的功能机制研究很少，仅知道其基因编码所在区esx-3与铁离子、锌离子的代谢有关。艾能等 ［3］ 成功构建了真核表达质粒P VAX1-TB10.4和P VAX1-GFP-TB10.4。将重组质粒P VAX1-TB10.4免疫小鼠，该质粒能够诱导低水平的抗体应答，同时诱发IFN-γ表达，并且能够加强BCG初次免疫后的免疫应答效果，为后续TB10.4蛋白生物学功能研究提供良好的生物材料。
Rv2004c是与缺氧相关的Mtb潜伏感染相关抗原之一，是一种保守的假想蛋白。王东方等 ［4］ 应用生物信息学技术对Rv2004c的表位进行预测和分析，发现该蛋白有10个候选B细胞抗原表位；37个候选Th细胞抗原表位，主要位于第200位氨基酸之后，其中HLADRB1*0401及HLA-DRB1*0701表型相对的表位数目较多，且某些候选表位的主要组织相容性复合体（MHC）限制类型存在交叉重叠；此外，该蛋白还有10个候选细胞毒性T淋巴细胞表位，其中以HLA-A2限制性表位数目较多、分值较高。
Rv2626c蛋白是感染Mtb后的休眠期受休眠调节因子DosR调控的特异性表达的48种蛋白之一，具有很强的免疫原性。其主要存在于感染Mtb后休眠期的细胞壁上，同时在菌体的培养液中也可以检测到。处于休眠期的Mtb感染者细胞壁上的Rv2626c蛋白会强烈地刺激机体T细胞的大量增殖，并大量释放IFN-γ和IL-2。为了研究Rv2626c与细胞凋亡的影响，孟露萍等 ［5］ 通过构建慢病毒表达载体p LEX-EGFP-Rv2626c，感染RAW264.7细胞，证实Rv2626c高水平过表达可显著促进细胞的凋亡，为进一步揭示Mtb的致病机制奠定理论基础。
李江英等 ［6］ 通过DNAStar软件预测结核分枝杆菌Rv3812蛋白的抗原表位，结果显示Rv3812蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段，共有8个潜在的B细胞抗原表位，该蛋白共有19个潜在的T细胞抗原表位，由此推测Rv3812是一个T细胞抗原表位占优势的蛋白抗原，B细胞抗原表位略少。
结核分枝杆菌ClpX（Rv2457c）属于AAA+ATP酶家族，具有底物识别以及ATP水解活性，可特异性地识别并解聚或重塑靶蛋白；也可与具蛋白水解酶活性的ClpP结合形成ClpXP异源二聚体，特异性地降解目的蛋白。ClpX是Mtb存活与致病所必需的，感染宿主后，ClpX下调自身细胞分裂蛋白FtsZ的活性，参与调控Mtb自身的细胞分裂。而作为细胞膜组分，ClpX可能是一种保守的毒力因子，参与Mtb与宿主的免疫互作。为了探索ClpX在感染宿主细胞过程中的作用机制，王亚倩等 ［7］ 通过酵母双杂交技术在人类淋巴细胞cDNA文库中筛选得到了一个新的与ClpX相互作用的蛋白UBC9，并利用GSTpull-down和Co-IP技术证实了这两个蛋白在体外和体内相互作用的特异性。将ClpX转染HEK293T细胞过表达，RNA干扰与回复实验进一步证实了ClpX蛋白能够通过与UBC9的相互作用抑制宿主细胞增殖。
（一）毒素-抗毒素系统
Mtb是一种包含大量毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin systems，TAS）的病原体，但是其中大部分TAS的功能作用尚不清楚。在对结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统作用机制的研究中发现，higB蛋白具有核糖核酸内切酶的活性，可特异性切割菌体内的mRNA，若higB蛋白累积，可阻碍细胞生长中的转录过程，进而导致翻译过程被遏止，细菌因缺少生存所必需的蛋白质而死亡。董娜等 ［8］ 采用PCR方法成功扩增Mtb H37Rv的higB基因，基因序列与GenBank上公布的Mtb标准株的核苷酸同源性为100%。运用生物信息学方法分析higB蛋白共125个氨基酸，分子质量单位为14.4298ku，理论等电点10.18，脂溶性系数77.36，不稳定系数35.67，预测该蛋白为稳定蛋白。higB蛋白无信号肽，其二级结构中β-转角占12%，无规则卷曲占34.4%，氨基酸序列中有3个潜在的B细胞抗原表位，4个Th细胞表位，5个磷酸化位点，这些结果为研究其生物学功能和免疫活性奠定了基础。
屈艳琳等 ［9］ 成功构建了Mtb毒素-抗毒素系统中mazEF3基因的过表达菌株，并且电转电压在2300V时，构建的过表达菌株mazEF3 mRNA表达量最高，为进一步研究Mtb毒素-抗毒素系统的生物学作用奠定基础。
（二）PhoPR双组分系统
PhoPR双组分系统不仅是12个Mtb双组分系统之一，而且是最基本、最重要的双组分系统。它能够感受外界微环境的改变，并及时调控自身各系统，包括RD l区域基因的表达水平、ESAT-6的分泌等，从而调控Mtb脂质代谢等方面，使得其在宿主体内得以生存。为进一步研究Mtb PhoPR双组份系统的功能，王君等 ［10］ 利用融合PCR和T载体克隆技术，成功获得Mtb的PhoP、PhoR和PhoPR缺失突变载体，为下一步构建Mtb突变株以及相关研究奠定基础。
（三）异柠檬酸裂合酶
异柠檬酸裂合酶（isocitrate Lyase，ICL）参与乙醛酸循环，是Mtb能在宿主体内潜伏的关键因素之一。为了研究ICL在Mtb持续感染宿主细胞过程中的作用机理，石超等 ［11］ 以ICL为诱饵，通过酵母双杂交技术在人淋巴细胞cDNA文库中筛选得到一个新的ICL相互作用蛋白CTBP1（C terminal binding protein 1）。然后分别采用GST pull-down和Co-IP实验证实了这两个蛋白在体外和体内与ICL相互作用的特异性，通过使ICL在HEK293T细胞中过表达，发现内源性CTBP1在转录水平和蛋白水平的表达都受到了抑制，同时导致细胞增殖减缓、凋亡加快，并出现G2/M期阻滞等改变。这些结果表明，Mtb ICL在参与介导细胞凋亡、影响宿主细胞活性的过程中起着重要的作用。
Mtb对β-内酰胺类抗菌药物的固有耐药性限制了β-内酰胺类抗菌药物在结核治疗上的应用，而A类（Ambler分类）β-内酰胺酶BlaC的表达是Mtb对β-内酰胺类抗菌药物耐药的最主要原因，抑制BlaC则可恢复Mtb对于β-内酰胺类抗菌药物的敏感性。Liu等 ［12］ 通过表达并纯化BlaC，构建了BlaC抑制剂的筛选模型，通过条件优化使该模型适用于高通量筛选，然后对26 400个化合物样品进行筛选，得到了22个BlaC抑制剂，这一研究为可用于临床的新型抗结核药物增效剂的发现奠定了基础。
Mtb rpoB基因编码RNA聚合酶的β-亚基，该基因的突变与利福平耐药相关。为了解rpoB基因突变特征与利福平耐药水平的关系，胡族琼等 ［13］ 测定266株Mtb，包括109株利福平耐药株和157株利福平敏感株的利福平MIC值及其rpoB基因序列。发现109株利福平耐药株rpoB基因皆发生错义突变，常见突变密码子531与526的突变频率分别为69.7%与17.4%。利福平耐药株中单密码子突变株占82.6%，多重密码子突变株占17.4%。531单密码子突变株与526单密码子突变株之间平均利福平MIC值无差异，但多重密码子突变株平均利福平MIC值（115.8μg/ml）显著高于单密码子突变株平均利福平MIC值（48.4μg/ml）。5.5%的利福平耐药株仅在rpoB基因起始端发生突变，推测rpoB基因起始端突变可能是除利福平耐药决定区域之外导致利福平耐药的第2个耐药决定区。rpoB基因DNA序列分析有助于Mtb利福平耐药表型和耐药水平的预测。
（陈艳清 李传友）
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摘要： 结核病是典型的胞内寄生菌诱导的感染性疾病，其感染、发病及预后判断等都与机体免疫功能息息相关。深入理解结核分枝杆菌诱导结核病发生的免疫学机制、免疫病理改变等对于结核病的预防、诊断、预后及新型结核疫苗的研发都具有十分重要的理论和实践意义。结核分枝杆菌诱导的免疫应答机制及参与因素十分复杂，主要涉及固有免疫及适应性免疫，其中又包括免疫器官、免疫组织、免疫细胞、免疫分子及免疫相关基因。
关键词： 固有免疫；适应性免疫；巨噬细胞；T淋巴细胞；细胞因子
结核病是由结核分枝杆菌感染所引起的传染病，是我国三大传染性疾病之一。由于目前唯一用于预防结核病的疫苗，卡介苗，对于成人结核病的预防效果不佳，近一个世纪未研发出有效的结核新型疫苗；半个世纪来无抗结核新药问世；加上AIDS/HIV的流行、结核合并糖尿病逐年增加、耐药结核病的流行，使得结核病的防控形势十分严峻。而无论是新型结核疫苗的研发，还是对于AIDS/HIV、糖尿病、耐药结核病等控制，都需要对于结核病发生过程中免疫学机制有更深入的认识和理解。
固有免疫应答（先天性免疫应答）是机体对抗微生物感染的第一道防线，在机体抗结核感染过程中发挥非常重要的作用。依据结核菌素试验（TST）或IFN-γ释放试验（IGRA）判断，只有30%密切接触者可成功感染结核菌，剩余的70%接触者，其强大的固有免疫应答可防止结核分枝杆菌感染（TST或IGAR阴性），这说明固有免疫系统在控制结核分枝杆菌感染中有极其重要的地位，决定了结核分枝杆菌感染的结局。除了作为防止结核分枝杆菌感染的“第一道防线”，固有免疫应答也是机体启动抗结核适应性免疫应答的前提。人体吸入结核杆菌后，结核分枝杆菌感染肺泡巨噬细胞，巨噬细胞不能控制结核分枝杆菌复制，导致细胞凋亡或坏死并传播到其他巨噬细胞。髓系树突状细胞（mDC）外周迁移到感染局部，mDC携带结核分枝杆菌从肺部运输到引流淋巴结，递呈抗原给T细胞，启动适应性免疫应答。适应性免疫应答激活后，其发挥效应也依赖于固有免疫细胞的参与，二者共同决定结核杆菌的最终结局。因此，固有免疫与适应性免疫并非截然独立，而是相互影响、相互调节、互为因果的关系。
固有免疫系统的组成包括免疫器官、免疫细胞、免疫分子及免疫相关基因。结核分枝杆菌感染机体后，结核分枝杆菌与固有免疫系统间相互作用，决定了结核分枝杆菌感染的结局及机体免疫应答发展的方向。结核分枝杆菌进入机体后首先感染巨噬细胞，维生素D是巨噬细胞功能的调节因子，维生素D可以通过提高被感染巨噬细胞中的吞噬小体和溶酶体的融合来降低结核分枝杆菌的生存能力，从而增强宿主抗结核分枝杆菌的能力。活动性肺结核患者血清中维生素D水平明显低于正常成年人，且与肺结核的严重程度相关 ［1］ 。半乳糖凝集素（Gal）为S型凝集素，可特异性识别β-半乳糖苷键，是固有免疫中重要的模式识别受体。它通过结合病毒、细菌、真菌和原生动物表面的寡糖，参与识别微生物，有效调节机体固有免疫及适应性免疫。活动性结核病患者血清中Gal-1表达水平异常升高，胞外Gal-1可增强巨噬细胞对结核分枝杆菌的杀伤功能。因此，Gal-1具有一定的结核病辅助诊断价值，并可能通过影响巨噬细胞功能参与结核病发病过程 ［2］ 。负性协同刺激分子程序性死亡分子1（PD-1）及其配体，程序性死亡分子配体（PD-L1），在感染、自身免疫和肿瘤中具有重要作用，尤其是近年来在肿瘤治疗上取得了非常显著的效果，在慢性病毒感染中，其参与T细胞功能耗竭。有研究提示小年龄结核病儿童，无论是肺结核还是肺外结核，外周血PD-1/PD-L1基因表达水平均升高，提示PD-1/PD-L1可能在小年龄儿童结核病致病机制中起着重要的作用 ［3］ 。
郭云等 ［4］ 研究了结核分枝杆菌主要分泌蛋白抗原85B（Ag85B）和卡介苗（BCG）对初治结核病患者DC免疫功能的调节作用，结果发现Ag85B和卡介苗能够增强初治结核病患者DC的免疫活性。
仝宇红等 ［5］ 探讨了Mtb感染后相关细胞亚群的变化，以及B7h-ICOS通路对Th1和Th17亚群的影响。结果发现体外刺激小鼠肺泡巨噬细胞可以剂量依赖方式导致IL-23、IL-12、IL-6和IL-1β分泌，阻断B7h-ICOS通路可抑制Th1和Th17亚群的分化。
结核分枝杆菌主要感染肺泡巨噬细胞，当结核分枝杆菌负担增加时，固有免疫应答启动适应性免疫应答。结核分枝杆菌与巨噬细胞表面特异性受体结合，摄取后形成吞噬体，部分成熟、酸化、加工，分别和HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子结合，递呈给CD8 + T和CD4 + T细胞。抗原特异性T细胞活化、扩增并迁移到肺部，通过活化巨噬细胞和细胞毒性T细胞靶向杀伤结核分枝杆菌感染的巨噬细胞，发挥有效抗结核分枝杆菌免疫应答。目前认为，T细胞介导的细胞免疫应答在控制结核方面发挥关键作用。
目前国内有关结核细胞免疫的研究主要集中在结核患者T细胞亚群，如CD3 + 、CD4 + 和CD8 + T细胞的绝对计数及相对比例上，而这并不能精确反映机体针对结核抗原特异性应答的T细胞的数量及其改变。此外，目前利用流式细胞仪，结合细胞表面标记及胞内细胞因子等免疫标记，已可将CD4 + T细胞及CD8 + T细胞进一步分为上百个亚群，而对于这些细胞亚群的精细划分有助于我们定向捕捉结核感染、发病及治疗过程中某个特定亚群的改变，以期找到与感染状态或疾病进程及预后评价相关的免疫标记。
初治结核病与复治结核病患者外周血CD4 + T及CD8 + T细胞水平对比无明显差异；复治肺结核组外周血CD4/CD8水平显著低于初治肺结核组 ［6］ 。肺结核组CD4 + T细胞绝对数低于肺部非结核疾病组，差异有统计学意义，CD4 + T细胞与肺结核的关联性具有统计学意义，且发生肺结核的危险性随CD4 + T细胞水平的增加而呈现下降趋势，结论CD4 + T细胞可作为评价肺结核的鉴别指标及其危险性趋势的辅助指标，有利于临床对肺结核病的发生发展进行免疫治疗及预防 ［7］ 。
在T淋巴细胞亚群（CD4 + 、CD4 + /CD8 + ）及NK细胞上，初治组>复治组和难治组，在T淋巴细胞亚群（CD3 + ）上，初治组>复治组>难治组，在T淋巴细胞亚群（CD8 + ）上，复治组、难治组>初治组 ［8］ 。
吴成周 ［9］ 研究发现，肺结核患者组患者外周血中CD3、CD4、CD8、CD4/CD8均明显低于健康对照组，尤以实验组中活动性肺结核患者明显（ P <0.01），而在静止性肺结核活动患者组外周血中CD4/CD8较对照组低，较活动性肺结核患者高；肺结核患者组血清中IL-1、IL-6、TNF-α的量明显高于对照，尤以实验组中活动性肺结核患者明显。细胞亚群及炎性因子在肺结核患者中发挥着重要的作用，其动态变化可以有效地显示患者免疫功能及患者病情的严重程度，对于判断和了解肺结核患者病情的变化以及评估其预后都要着重要的价值。
刘宁等 ［10］ 探讨了肺结核患者肺泡灌洗液淋巴细胞亚群的变化及治疗前后外周血中淋巴细胞亚群的变化。作者比较了患者患侧与健侧肺泡灌洗液中T淋巴细胞和NK细胞水平，并比较治疗前后患者外周血中T淋巴细胞和NK细胞水平。结果显示，患侧肺泡灌洗液中CD4、CD4/CD8比值及NK细胞水平均显著低于健侧，而CD8水平显著高于健侧。治疗后患者外周血中CD4、CD4/CD8比值及NK细胞水平明显高于治疗前，说明对肺泡灌洗液及外周血中淋巴细胞亚群进行检测有助于肺结核的早期诊断及预后观察。
目前对于Th1或Th2亚群的鉴定主要依据其功能即分泌细胞因子的类型进行区分。分别经结核特异性优势抗原Ag85B和PPD刺激活动性结核患者外周血单个核细胞（PBMC），Ag85B蛋白刺激后Th1型细胞因子IFN -γ、IL-2浓度明显高于PPD刺激组，而Th2型细胞因子IL-4、IL-10等水平无显著差异 ［11］ 。
为明确CD4 + T淋巴细胞及其亚型相关细胞因子与结核病进展的相关性，李晓红等 ［12］ 对肺结核患者CD4 + T淋巴细胞进行计数，并采用流式细胞微球阵列技术（CBA）检测了细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的含量，探讨其抗结核治疗前后的变化。结果显示，92例肺结核患者外周血CD4 + T细胞的水平较健康对照组低，患者IFN-γ、IL-2水平降低而IL-4、IL-10水平明显提高；抗结核治疗后Th1细胞水平增加，Th2细胞水平降低，Th1/Th2应答平衡逐渐恢复。由此可见，外周血CD4 + T细胞计数以及Th1和Th2细胞相关细胞因子水平的动态监测有助于对肺结核患者预后情况的评价。
细胞因子是由免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。在结核分枝杆菌感染过程中，细胞因子同样参与并调节机体与结核分枝杆菌的相互作用，细胞因子作为一个复杂的网络，其产生、作用及调控都十分精密复杂，细胞因子网络与结核杆菌的感染、病理及发病机制密切相关，对于结核病的诊断、鉴别诊断、治疗及预后判断都具有十分重要的意义和价值。
结核性胸膜炎患者胸腔积液中IL-6、IL-18表达水平显著高于恶性肿瘤患者，可作为临床鉴别诊断的参考指标 ［13］ 。结核性胸腔积液和细菌性胸腔积液中IL-22浓度较血清显著增高，IL-22很可能参与感染性胸腔积液的免疫学发病过程。胸腔积液中IL-22浓度测定可有效鉴别感染性与恶性胸腔积液 ［14］ 。IL-18、IL-6及NO均是抗结核感染免疫的重要调节细胞因子，血清IL-18、IL-6和NO水平与多耐药种类有关，其血清水平可作为监测复治肺结核病情活动和转归的重要指标，可以预知复治肺结核治疗方案的有效性 ［15］ 。
与健康对照组比较，结核患者血浆中IL-24水平下降；与初治组比较，复治组IL-24水平下降，IL-24水平与肺结核的发生、发展密切相关，低IL-24水平可能是肺结核初治患者失败或治愈后复发的重要原因 ［16］ 。
IL-10是已知炎症反应的主要生理抑制剂，主要抑制巨噬细胞的活动，减轻炎症反应程度，抑制促炎因子的过度炎症反应，在肺结核的发病过程中起到负调节作用。肺结核患者治疗前IL-10表达水平高于健康者，而IL-22、IL-23水平低于健康者，经常规抗结核治疗6个月后，IL-10水平显著降低，可能机制为通过下调IL-10增强Th1型免疫应答从而减弱Th2型免疫应答，最终增强机体对结核的有效免疫反应；而IL-22、IL-23表达水平上升，推测IL-22、IL-23可能通过增强巨噬细胞清除结核分枝杆菌而协同发挥抗结核作用 ［17］ 。
复治患者治疗前IL-10的血清水平高于初治患者，结核治疗后，IFN-γ、IL-2、IL-10血清浓度下降，Thl/Th2比值下降 ［18］ 。糖尿病小鼠感染结核菌后，TNF-α较单纯糖尿病组出现更显著升高，小肠黏膜病理形态学改变更为严重。结核感染后机体通过免疫相关基因等多种机制使TNF-α表达增加，在糖尿病时糖、脂、蛋白及免疫功能紊乱，营养不良，酸性环境，免疫调节紊乱等背景下，结核菌生长繁殖加快，病情进展迅速，进而导致TNF-α呈持续过多性病理性升高 ［19］ 。与健康对照组相比，肺结核患者血清中sTim-3和IL-4水平显著升高，IFN-γ水平显著降低；Pearson分析显示：sTim-3与IFN-γ、IFN-γ与IL-4呈负相关；而sTim-3与IL-4呈正相关 ［20］ 。
汪炼超等 ［21］ 探讨了肺结核患者的血清与痰上清液中白介素4（IL-4）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）、转化生长因子 β（TGF-β）的表达及临床意义。结果显示，肺结核患者痰上清液中IL-4、TNF-α、IFN-γ、TGF-β水平显著高于血清；痰菌量为++++的痰上清液中的IL-4、TNF-α、IFN-γ、TGF-β的水平显著高于痰菌量为+～+++的。提示肺结核患者痰上清液中IL-4、TNF-α、IFN-γ、TGF-β表达水平明显高于外周血，随着痰菌量的增多，痰上清液中IL-4、TNF-α、IFN-γ、TGF-β 的表达水平不同程度升高。
（李丽 朱国锋 李平俊 刘一典 唐神结）
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