酶活性的高低用酶活性单位(U)来表示。酶活性单位是指在适宜的反应条件下,单位时间内酶促反应过程中消耗一定量的底物或生成一定量的产物所需的酶量,有习惯单位和国际单位两种表示方法。习惯单位是根据不同的实验方法定义出来的酶活性单位,不同的酶由于测定原理方法的不同其使用的单位代表的含意不一样;同一种酶其测定方法不同表示的活性单位也不同,其测定结果没有可比性,更不能替代。但是,由于习惯单位使用的便利性,我国目前临床上仍然在使用习惯单位。国际单位(International unit,IU)是国际酶学委员会(IEC)于1976年制定的酶活性单位的统一标准:在最适宜的条件下,每分钟催化1μmol/L底物转化为产物所需的酶量为一个酶活性单位,即1IU;1979年,IEC又推荐了一个新的酶活性单位——催量(Kat),其规定在最适宜的条件下,每秒钟催化1mol/L底物转化为产物所需的酶量为1Kat。催量与国际单位之间的换算关系为:1Kat=6×10 7 IU;1IU=16.67×10 -9 Kat。在进行科学研究及发表学术论文时必须使用国际单位。
酶类制剂的来源原则上选取酶含量高的材料,可以是天然的动植物,也可以是人工培养的微生物、动植物细胞等。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料限制,成本又高,因此,目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。另外,从理论上讲,酶也可以通过化学合成法获得,但由于试剂、设备和经济条件等诸多因素的限制,人工合成法生产酶,还需相当长的时间。
酶的制备一般包括四个基本步骤,即预处理、提取、纯化和结晶(或制剂)。首先将所需要的酶从原料中引入溶液,此时不可避免地要夹带着一些杂质,而后再将酶从溶液中选择性地分离出来,或者从酶溶液中选择性地除去杂质,最后制成纯净的酶制剂。
生物细胞产生的酶有两类:细胞外酶和细胞内酶。细胞外酶只需用水或缓冲液浸泡,滤去不溶物,就可得到粗提液。细胞内游离存在的“离酶”以及与亚细胞结构(如细胞核、线粒体、微粒体、质膜)结合的“结酶”都要先破碎细胞才能使酶释放出来,然后再进行抽提。
对酶类的提取可采用多种方法,现将常用的细胞破碎法简介如下(原则上要求在不影响或较少影响酶活性的情况下,达到较好的破碎效果):
1.机械法 如绞碎、研磨、组织匀浆、高压匀浆、超声波法等。
2.化学法 用盐、碱、表面活性剂、EDTA、丙酮和正丁醇等可使细胞破碎、亚细胞结构解体,从而把酶释放出来。例如常将胰脏用数倍量丙酮处理2~3次,制成丙酮粉供多种酶的提取用;用胆汁酸盐处理膜结构上的脂蛋白和“结酶”,使两者形成复合物,并带上静电荷,由于电荷之间的排斥作用,使膜破裂,达到溶解。
3.酶解法 用组织自溶或溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、磷脂酶等降解细胞壁、膜结构,然后再进行提取。但组织自溶对某些酶的提取是不利的,如胰蛋白酶是以酶原形式纯化后再激活成胰蛋白酶的,若用自溶法提取,酶原已转成酶,纯化就很困难。而用纯工具酶降解法虽无此缺点,但成本较高。
4.冻融法 采用反复冷冻与融化交替进行。由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂。
5.干燥法 干燥方法很多,常见有空气干燥、真空干燥和冷冻干燥三种。获得的酶质量最高的是冷冻干燥。空气干燥法特别适用于酵母。样品过筛(10目)后,在25℃~30℃条件下吹风干燥,干燥后酵母已部分自溶,用水将其悬浮,搅拌提取2~3h。喷雾干燥法由于温度较高,对热稳定较差的酶不适用。真空干燥法对细菌特别适用。菌体经真空干燥过夜后,已产生自溶,干菌结成硬块,需磨碎再用水提取。对敏感性强的酶,如巯基酶,有时需加少量还原剂,如谷胱甘肽、巯基乙醇、半胱氨酸、亚硫酸钠等进行保护。冷冻干燥对较敏感的酶较实用,一般用10%~40%悬液进行冷冻干燥,得到的冻干粉可较长时间保存。
一般在提取前,通过调查研究、文献检索,详细了解欲提取酶的性质,例如等电点、最适pH值、最适温度、激活剂、抑制剂、稳定性等,然后选择合适的方法。根据酶的结构和溶解特性来选择适当的提取液。通常极性物质易溶解于极性溶剂,反之,非极性溶液易溶解于非极性溶液(相似相溶);酸性物质易溶解于碱性溶液,反之,碱性物质易溶解于酸性溶液。酶通常都溶于水,因此常用的提取液用水作为溶剂或配制成一定浓度的稀酸、稀碱、稀盐溶液进行抽提。有些酶与脂质结合或者含有较多的非极性基团,则可用有机溶剂抽提,如丙酮粉有助于将酶与脂肪或磷脂膜分离;高离子强度(0.1~0.5 mol/L)有助于将酶从结合的膜上解析下来。
提取方法主要有水溶液法、有机溶剂法和表面活性剂法三种。
1.水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲溶液提取。经过预处理的原料,包括组织糜、匀浆、细胞颗粒以及丙酮粉等,都可用水溶液抽提。为了防止提取过程中酶活力降低,一般在低温下操作。但对温度耐受性较高的酶如超氧化物歧化酶,却应提高温度,使杂质蛋白变性,以利于酶的提取和纯化。pH值的选择对提取也很重要,应考虑酶的稳定性、酶的溶解度及酶与其他物质结合的性质。选pH值的总原则是:在酶稳定的pH值范围内,选择偏离等电点的适当pH值。一般来说,碱性蛋白酶用酸性溶液提取,酸性蛋白酶用碱性溶液提取。
许多酶在蒸馏水中不溶解,而在低盐浓度下易溶解,所以提取时加入少量盐可提高酶的溶解度。盐浓度一般以等渗为好,相当于0.15mol/L NaCl的离子强度是最适宜于酶的提取。
2.有机溶剂法 某些结酶如微粒体和线粒体膜的酶,由于和脂质牢固结合,用水溶液很难提取,为此必须除去结合的脂质,且不能使酶变性。最常用的有机溶剂是丁醇,因其具有下述性能:①亲脂性强,特别是亲磷脂的能力;②兼具亲水性,在0℃水中的溶解度为10.5%;③在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。
丁醇提取法有两种:①均相法:加少量丁醇,搅拌成均相,长时间抽提后离心取下层液相层。但许多酶在与脂质分离后极不稳定,需加注意。②二相法,适用于易在水溶液中变性的材料,在每克组织或菌体的干粉中加5mL丁醇,搅拌20分钟,离心后取沉淀,然后用丙酮洗去沉淀上的丁醇,再在真空中除去溶剂,所得干粉可进一步水提取。
总而言之,酶的提取溶剂可以用水、一定浓度的乙醇、乙二醇、丁醇和稀盐溶液、缓冲溶液等,也可以用稀碱或稀酸溶液。如用稀硫酸提取胰蛋白酶,用稀盐酸提取胃蛋白酶。溶剂用量一般为原料重量的1~5倍。搅拌可加速提取,但转速不宜太快,否则会产生泡沫而难以过滤或可能使酶变性。多数酶的提取要在低温下操作,一般在-5℃~+40℃间适当选择。但有的酶在较高温度下提取更好,如胃蛋白酶在45℃时提取率较高。提取液的pH值应在酶的稳定pH值范围内,并应远离其等电点为宜。如蛋白酶选用的pH值为2.5~3.0,胰蛋白酶和α-糜蛋白酶则用0.125 mol/L硫酸提取。若用中性或碱性液提取时,最常用的是0.15 mol/L氯化钠、0.02~0.05mol/L磷酸缓冲液、0.02~0.05mol/L焦磷酸缓冲液。正丁醇的亲脂性强,能透入酶的脂质结合物中,又兼有亲水性,有类似表面活性剂的作用,适用于提取“结酶”。
提取的酶液为减少纯化操作容积,通常先进行浓缩。工业上可用真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩和逆向渗透作用进行浓缩。对于少量酶液可用葡聚糖凝胶(分子筛)或聚乙二醇吸水浓缩,也可根据酶的分子量选择合适的超滤膜进行超滤法浓缩。
酶是蛋白质,因此凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化。如离心法、盐析法、聚乙二醇沉淀法、有机溶剂分级沉淀法、等电点法、选择性沉淀法、各种柱层析法(吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤)、各种电泳法及亲和层析等。不同之处是酶的纯化过程尚需选用迅速简便的活力测定方法,以追踪酶的去向。在建立活力测定法之后,再根据各单元纯化步骤及活力分布情况,用列表形式表达。
一个典型的酶纯化过程常包括多个单元操作,各单元操作如何串联,需靠实践摸索。每经过一个步骤一般可提高酶纯度2~3倍,总纯度可提高数千倍,而总产率常仅百分之几或十几。总的原则是,选用最少的步骤而能取得最好的纯化效果。增加步骤势必增加酶的丢失。通常对于含盐浓度高的粗提取液一般不宜采用吸附法而多用盐析法;对于低离子强度的酶溶液则可用吸附法或离子交换法。交替使用不同分级沉淀法常比单独重复同一类型方法更能奏效。所以常将吸附法、盐折法和有机溶剂分级沉淀法串联起来进行纯化。当这些方法仍达不到要求时,还可以采用一些包括电泳、层析法在内的其他类型纯化方法。
1.杂质的去除 酶提取液中常含有杂质蛋白、多糖、脂类及核酸等杂质,可用下述方法去除:
(1)pH和加热法 利用蛋白质对酸、碱和热变性等性质的差异,可去除非活性杂质蛋白。如制备脂肪酶时,在pH值3.4、40℃温度加热150分钟,淀粉酶活力可丧失90%而被除去,而脂肪酶活力仍保持80%以上。
(2)蛋白质表面变性法 蛋白质表面变性后其性质有所不同,借以去除杂质蛋白。如制备过氧化氢酶时,加入氯仿和乙醇进行振荡可以将杂蛋白变性而去除。
(3)蛋白质沉淀剂法 利用醋酸铝、利凡诺、单宁酸、离子型表面活性剂等蛋白质沉淀剂可以去除杂质蛋白及黏多糖类杂质。使用时要注意这类试剂常可引起酶变性失活,因此应迅速除去。
(4)选择性变性法 各种蛋白质对变性剂的稳定性不同,可以用选择性变性剂去除杂蛋白。如细胞色素C对三氯醋酸较稳定,所以在制备时可用2.5%三氯醋酸使其他杂质蛋白变性沉淀除去。
(5)加保护剂热变性法 酶与底物或竞争性抑制剂结合后,其稳定性常显著增加。所以常用它们为保护剂,再用高温等手段破坏杂蛋白。如用D-甲基苯甲酸为D-氨基酸氧化酶的保护剂,经加热除去杂蛋白,使该酶得到很好的提纯。
(6)核酸沉淀剂法 酶液中的核酸类杂质,可以用氯化锰、鱼精蛋白硫酸盐等沉淀剂使其沉淀而除去。必要时,也可用核糖核酸酶将核酸降解后除去。
2.脱盐 在酶的提纯以及酶的性质研究中,常常需要脱盐。最常用的脱盐方法是透析和凝胶过滤。
(1)透析 最广泛使用的是玻璃纸袋。它有固定的尺寸、稳定的孔径,有商品出售。由于透析主要是扩散过程,如果袋内外的盐浓度相等,扩散就会停止,因此要经常更换透析液,一般一天换2~3次。如在低温下透析,则溶剂也要预冷,避免样品变性。透析是否完成,可用化学试剂或电导仪来检查。
(2)凝胶过滤 这是目前最常用的方法,不仅可以除去小分子的盐,而且可除去其他的小分子量的有机物。用于脱盐的凝胶主要有Sephadex G-10,Sephadex G-15,Sephadex G-25以及Bio-Gel P-2,Bio-Gel P-4,Bio-Gel P-6及Bio-Gel P-10等。
当酶达到一定纯度和浓度后,加入晶种,在一定条件下,经缓慢的过程,使酶的溶解度降低,酶慢慢结晶出来。时间可以从几小时,几天,几个月,甚至几年。结晶也是纯化酶的有效手段之一。但药用酶有些并不需要结晶。
1.盐析法 在适当的pH值、温度等条件下,保持酶的稳定,慢慢改变盐浓度进行结晶。常用的盐有硫酸铵、柠檬酸钠、乙酸铵、硫酸镁和甲酸钠等。利用硫酸铵结晶时,操作要在低温下进行(低温时酶在硫酸铵溶液中溶解度高,温度升高溶解度降低),且缓冲液的pH值要接近酶的p I。一般是把盐加入到一个比较浓的酶溶液中,使溶液呈轻微浑浊然后放置,并且非常缓慢地增加盐浓度。我国利用此法已得到羊胰蛋白酶原、羊胰蛋白酶和猪胰蛋白酶的结晶。当把酶的抽提液放置在室温时,蛋白质会逐渐析出,多数酶就可以形成结晶。有时也可交替放置在4℃冰箱中和室温下来形成结晶。
2.有机溶剂法 酶液中滴加有机溶剂,有时也能使酶形成结晶。这种方法的优点是结晶悬液中含盐少。常用的有机溶剂有:乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、异丙醇、二噁烷、二甲亚砜、二氧杂环己烷等。与盐析法相比,有机溶剂法易使酶失活。一般在含少量无机盐的情况下,选择使酶稳定的pH值,缓慢地滴加有机溶剂,并不断搅拌,当酶液呈微混浊时,在冰箱中放置1~2h,然后离心,取上清液在冰箱中放置使其结晶。加有机溶剂时,必须不使酶液中所含的盐析出。所使用的缓冲液一般不用磷酸盐,而用氯化物或乙酸盐。用这种方法已获得不少酶结晶,如L-天冬酰胺酶。
此外,还有复合结晶法、透析平衡法、等电点法等。酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度,使其略处于过饱和状态,一般新样品往往要使用几种方法才能得到结晶。
结晶成功的关键因素:①一定的浓度:通常浓度越高,越易结晶;但浓度过高后会致结晶不容易长大,浓度要在1%~5%为宜。②纯度要高:至少50%以上;纯度越高越易结晶。③酶要有活性。
酶分离纯化的基本原则:①切记多数酶是蛋白质,防止酶失活变性。a.低温;b.一般中性,pH<4或>10不稳定;c.防重金属、有机溶剂、微生物及蛋白酶污染。②追踪酶分离每一步的总活力和比活力,判别每步方法的可行性。
选择纯化方法时注意事项:①样品的体积、酶和杂质的数量、pH值及离子强度。②酶的物理化学性质:大小、等电点、溶解度、亲水性。③需要纯化的酶的生物学性质:稳定性、辅助因子等。
分离方法的顺序选择:样品量由大到小,分辨率由低到高,酶的回收率由低到高。
酶的纯度(酶蛋白的均一性),可用多种方法相互验证。酶可作研究对象、药用、实验或生产用试剂。不同的用途要求的纯度不同。作为静脉注射用酶就不能有热源。作为工具酶,无杂酶,否则不可能有准确无误的切点,以供基因工程工作。作氨基酸顺序分析用酶,需构象测定、理化性质测定,要求很高。
酶的纯度问题是一个很复杂的问题。首先,对酶纯度的要求因工作需要各异。其次,酶均一性纯度,看起来似乎是一个很明确的概念,但它是指不含杂质而言。其实它只是一个相对的指标,要受所用检测方法分辨力的限制,并且世界上没有绝对纯的物质,所以对具体问题要具体分析,避免简单化。
最后一步纯化过程得到的酶液,需经浓缩或结晶以及其他处理,将酶液过滤除菌,以减少微生物降解作用,以便于保存。在合适的条件下,酶一般可保存较长的时间。在4℃下,可将酶悬浮在浓硫酸铵或PEG溶液中保存。浓酶液可加入25%~50%甘油保存。丝氨酸转羟甲基酶结合于Cibacron blue F3G-A染料配体亲和柱上,于4℃保存,非常稳定。类似的方法可用于其他酶的保存。需还原性巯基维持催化活性的酶,可与1mmol/L的ED-TA及还原性巯基试剂一起在液氮中保存。许多酶在冰冻状态下保存得很好。
1.生产工艺
(1)工艺流程(图4-14)
图4-14 L-天门冬酰胺酶生产流程示意图
(2)操作过程
①菌种培养 菌种为大肠杆菌A.S.I.375,普通牛肉培养基,接种后于37℃培养24小时。
②种子培养 16%玉米浆,接种量1%~1.5%,37℃温度,通气搅拌培养4~8h。
③发酵罐培养 玉米浆培养基,接种量8%,37℃通气搅拌培养6~8h,离心分离发酵液,得菌体,加2倍量丙酮搅拌,压滤,滤饼过筛,自然风干成菌体干粉。
④提取、沉淀、热处理 每千克菌体干粉加入0.01mol/L、pH8的硼酸缓冲液10L,37℃保温搅拌1.5h,降温到30℃以后,用5mol/L的醋酸调节pH值为4.2~4.4,进行压滤,滤液中加入2倍体积的丙酮,放置3~4h,过滤,收集沉淀,自然风干,得干粗酶。
取干粗酶,加入0.3%甘氨酸溶液,调节pH值为8.8,搅拌1.5h,离心,收集上清液,加热到60℃并保持30分钟。离心弃去沉淀,上清液加2倍体积的丙酮,析出沉淀,离心,收集酶沉淀,用0.01mol/L、pH值8磷酸缓冲液溶解,再离心弃去沉淀,得上清酶溶液。
⑤精制、冻干 上述酶溶液调节pH值为8.8,离心弃去沉淀,上清液再调pH值为7.7,加入50%聚乙二醇,使浓度达到16%。在2~5℃放置4~5天,离心得沉淀。用蒸馏水溶解,加四倍量的丙酮,沉淀,同法反复一次。沉淀用pH值6.4、0.05mol/L磷酸缓冲液溶解,50%聚乙二醇再处理一次,即得无热原的L-天门冬酰胺酶。将其溶于0.5mol/L磷酸缓冲液,在无菌条件下用6号垂熔漏斗过滤,分装,冷冻干燥制得注射用L-天门冬酰胺酶成品。
2.活力测定方法 L-天门冬酰胺酶催化天门冬酰胺水解释放游离氨,奈斯勒试剂与氨反应后形成红色络合物,用比色法进行定量测定。
取1mL0.04mol/L的L-天门冬酰胺、0.5mol/LpH值8.4的硼酸缓冲液、0.5mL细胞悬液或酶液,于37℃水浴中保温15分钟后加0.5mL15%三氯乙酸以终止反应,沉淀细胞或酶蛋白,离心取上清液1mL,加入2mL奈斯勒试剂和7mL蒸馏水,15分钟后,于500nm波长处比色测定产生的氨。
活力单位定义:每分钟催化天门冬酰胺水解产生1μmol氨的酶量为一个活力单位。
3.用途 L-天门冬酰胺酶临床上主要用于治疗白血病。