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在对付那群表面上较弱的清教徒方面，她却未获胜利。他们是受加尔文影响的教徒，其中某些人是玛丽统治时期流亡于外的难民，他们曾经访问加尔文教派重地日内瓦，多数人曾经阅读日内瓦加尔文教派翻译并注释的《圣经》，某些人曾听过或读过约翰·诺克斯的鼓吹文章，某些人也许听过威克利夫“可怜教士”罗拉（Lollard）的回声。以《圣经》为绝对可靠的指南，他们发现伊丽莎白将主教权利和教士法衣由罗马手中夺取转交于英国国教，在《圣经》上找不到根据。一方面，他们发现教士除基督外并不受国王的统治。他们承认伊丽莎白是英国国教的领袖，但其目的只是要摒弃教皇而已。他们在心中杜绝国家控制宗教之说，反而希望以其宗教来控制国家。1564年，他们开始被称为“清教徒”——这是一句骂人的话——因为他们想澄清英国新教《新约》未有记载的各种信仰和礼拜的形式。他们采取预定论、上帝选民论及天罚论，并主张唯有生命的各方面合乎宗教和道德标准，才能脱离炼狱之苦。严肃的星期天他们在家中研读《圣经》时，面对着《旧约》中善嫉和记仇的耶和华，耶稣的形影仿佛已经消失了。
在剑桥大学神学教授托马斯·卡特莱特（Thomas Cartwright）发表演讲，强调早期基督教教会长老组织与英国国教主教组织之间的对照比较时，清教徒攻击伊丽莎白已具体化了（1569年）。剑桥的许多教职员支持卡特莱特的主张，但三一学院（Trinity College）院长约翰·惠特吉夫特（John Whitgift）在女王面前谴责他，使他被解除教职（1570年）。卡特莱特移居日内瓦，在西奥多·德贝兹（Theodore de Beze）的领导下，吸收了加尔文教派神权国家论的精华。回到英国后，他与沃尔特·特拉瓦斯（Walter Travers）及其他人合作，建立清教徒的教会，依其意见，耶稣已经安排让各个教区、各省及各国选出的牧师和世俗长老拥有全部教会权力。如此组成的教士和长老会有权依据《圣经》决定教条、礼仪和道德律。他们应与每个家庭联系，有权促使大家至少表面上过着“事神的生活”，并有权将抗命者驱逐教籍，处异端以死刑。民政官应执行戒律，但国家不得侵入宗教管辖权的领域。
1572年，旺兹沃思城（Wandsworth）首先按照这些原则建立了第一个英国教区，而在东部和中部乡间也兴起了相似的“长老会”。此时，多数的伦敦新教徒和平民院议员是清教徒。伦敦技工阶级，已为法国和荷兰加尔文教派难民所渗透，纷纷攻击主教组织及其礼仪。城市商人把清教派视为新教，抵抗在传统中不同情高利贷者的天主教条及中产阶级的中坚。加尔文对此也有严格限制，可是他曾经鼓励放息，而且承认勤勉节俭的美德。就是女王也发现清教有某些优点。假若玛丽·斯图亚特能入主英国，塞西尔、莱斯特、沃尔辛厄姆及诺克斯均有望借重清教来对付天主教。
但伊丽莎白觉得清教运动阻碍其减少宗教纷争的整个计划。她把加尔文教派视同与约翰·诺克斯的理论一样，而约翰·诺克斯轻视妇女统治者永不被她原谅。她轻视清教教条主义实较天主教为甚。长久以来伊丽莎白一直喜欢耶稣受难像及其他神像，她即位初期，反偶像的狂潮曾摧毁了一切圣画、圣像及染色玻璃，她下令赔偿损失与牺牲者，并禁止以后采取这种行动。她对自己的言语并不吹毛求疵，但讨厌某些清教徒把通用祈祷书描写为“取材自教皇粪堆的弥撒书”，把高级宗教法庭描述为一条“小臭水沟”。她认为民选大臣及由长老和宗教大会组成的教会组织应独立于国家，不受国家干涉，但这种共和体制威胁了君主政体。她认为只有保持其君主权力才可以使英国维持为新教国家，而人民普选会导致天主教的恢复。
她鼓励主教们阻挠这些妨害秩序者。大主教巴尔克禁止他们印书宣传、在教会中禁止他们发言、阻止他们集会。清教教士曾经集会公开讨论《圣经》，伊丽莎白命令巴尔克查禁这些“伪行知”（prophesyings），他立即照办。其继承人埃德蒙·格林德尔（Edmund Grindal）试图保护清教徒，伊丽莎白暂夺其权位。他死后（1583年），她提升新主教约翰·惠特吉夫特至坎特伯雷任职。此人致力于压制清教徒，他要求英国全部教士宣誓接受“三十九条款”、通用祈祷书及女王宗教最高地位。他传唤反对者至最高宗教法庭受审，在那里他们的行为和信仰受到详细而持续不断的审问，塞西尔将这种审判程序与西班牙异端裁判相提并论。
清教徒反叛的情况日益严重。一小群立场坚定的人公然与英国国教会分离，自建独立教会，选举他们的牧师，不肯承认天主教的统治权。1581年，卡特莱特的学生（其后为敌人）罗伯特·布朗（Robert Browne），是“独立派”、“分离派”或“自主集会派”的主要发言人，他远赴荷兰，在那里发表了两篇短文，其中包含基督教的民主宪法大纲，即任何基督教派均有权自行集会礼拜，依据《圣经》自定其教义、自选其领袖、不受外来干涉而过其宗教生活，除《圣经》外可以不承认其他法规，除基督外可以不承认其他权威。他的两位信徒在英国被捕，经判决定罪为轻蔑女王宗教最高权威地位，被绞死（1583年）。
在1586年国会议员选战期中，清教徒对不同情他们的候选人尽情予以攻击。有一位被称为“平凡的赌棍和赌注之友”，另一位则是“对教皇制度颇表怀疑，很少上教堂礼拜的妓院的龟公”。那是口诛笔伐的时代。国会集会时，约翰·彭利（John Penry）发表请愿要求改革教会，指责主教应为教士的滥权及流行的异端邪学说负责任。惠特吉夫特下令将之逮捕，但不久他又获得释放。安东尼·柯普（Antony Cope）提出议案拟废止整个主教组织，并依据设置长老的设计而改组英国国教。伊丽莎白下令国会不得讨论该议案。彼得·温特沃思（Peter Wentworth）起而询问国会自由何在，4名议员也对此表示支持，伊丽莎白将这5人关入伦敦塔。
在国会受到挫败，彭利及其他清教徒转而诉诸舆论。为了避免惠特吉夫特严格的新闻检查，他们私自印行了一连串的小册子，广传于英国境内（1588—1589年），均署名绅士马丁·马伯里雷特（Martin Marprelate），并以讽刺谩骂的言词攻击主教的权威和个人人格。惠特吉夫特和最高宗教法庭广布密探，想要找出作者和印刷者；但是印刷者在城市之间流动，又得到公众的同情协助，直到1589年4月仍未被发现。职业作家如约翰·李利和托马斯·纳什（Thomas Nash）答复马丁的文章，反使他大肆讽骂，针锋相对，最后竟然有泼妇骂街的情形。后来争议逐渐平息，正人君子为基督教竟堕落成破口大骂的艺术悲痛不已。
受了这些小册子的刺痛，伊丽莎白给予惠特吉夫特全权压制这些清教徒。所谓马伯里雷特的那群印刷人终被找到，政府大肆逮捕，跟着就处死很多人。卡特莱特被判决处死，却被女王特加赦免。两名“伯朗运动”（Brownian Movement）领袖约翰·格林伍德（John Greenwood）和亨利·巴罗（Henry Barrow）于1593年被绞杀，其后不久，约翰·彭利也遭绞刑。国会随后决议（1593年），任何怀疑女王的最高宗教地位或继续不参加英国国教礼拜而参加“任何非国教的秘密聚会或秘密假做礼拜的会议者”，应予拘禁，而且——除非保证将来改宗国教礼拜仪式——应永远离开英国，否则处死。
就在此时，介于纷扰争端中，一位温和派牧师将争端升华为关于哲学、敬神及庄严的散文层次。理查·胡克（Richard Hooker）是奉派在伦敦寺（the London Temple）布道的教士之一，另一位是卡特莱特之友特拉瓦斯。晨间讲道，胡克阐述伊丽莎白的宗教政策；到了下午，特拉瓦斯就依清教徒的主张批评教会政府，两人均将其讲稿集印成书。胡克能撰述文学和神学著作，因此他请求主教将他调至安静的乡间教区。他在维特郡（Wiltshire）的博斯坎比（Boscombe）完成巨著《论宗教政府的法律》（The Laws of Ecclesiastical Polity）的前4册（1594年），3年后在毕晓普斯堡（Bishopsbourne）他又将第5册送到报上发表。1600年他卒于该地，享年47岁。
他的《法律》一书，其论证在平和中显出高尚的风格，兼有拉丁风格的华丽文藻和磅礴的气势，因而震惊了英国。枢机主教艾伦赞其为英国有史以来最佳杰作，教皇克莱门特八世嘉许其滔滔雄辩和博学广识，女王伊丽莎白感激地阅读，视为替其宗教政府做了合理的辩护，清教徒为其词意温和明晰而感到心平气和，后世视之为寻求宗教与理性平衡的卓越尝试。胡克承认就是教皇也可获救，这使当代人感到惊奇。他又宣称：“依据上帝启示我们的信仰而得到的保证，对于我们来说，还不如通过知觉而得信仰的保证更为确定具体。”这也使许多神学家感到震惊，其意即谓人类的理性能力也是上帝赋予的神圣礼物和启示。
胡克的法律理论源自圣·托马斯的中古哲学，他开了托马斯·霍布斯与约翰·洛克“社会契约论”的先河。在说明社会组织的必要性及其利益后，他辩称自动参加社会即表示愿意受法律的统治。但是法律的最终根源是在社会本身，君主或国会发布法律实受社会的委托授权。他又加上一段很可能为查理一世借鉴的文章：
英国国会以及附依其上的（宗教）大会，是本王国统治的根本所赖，甚至是整个王国的实体所在。它包括君主及王国受其统治的子民在内，因为他们都已在那里了，或是本人直接在那里，或是已主动放弃（委任）其权利了。
他认为宗教是国家内在的构成部分，因为社会秩序乃至物质繁荣必赖道德规律，而道德规律如无宗教的指导和支持，必归于崩溃，因此各国应对其人民施以宗教训练。英国国教固是不完整，可是其他亚当子孙组成的教会也是如此。
胡克的逻辑理论迂回而不够深入，缺少说服力，其学识局限于经院哲学，因此未能解决当时的问题，其感激社会秩序的立论，使他不能了解追求自由之背景。清教徒承认其文章流利通顺，但仍自行其是。许多人因为被迫在国家与信仰间做一选择，因而向外移民，正好与大陆新教徒移入英国的路线相反。荷兰欢迎他们，于是英国人将教会建于米德尔堡（Middelburg）、莱登（Leiden）、阿姆斯特丹。在那里，流亡者及其子孙辛苦工作、教育、传道及写作，心情平静地准备完成他们在英国的胜利和在美洲的建树。