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现在轮到天主教徒受迫害了。虽然他们占大多数，但不得做天主教礼拜及拥有天主教书籍。政府下令毁坏天主教堂中的宗教偶像，并把圣坛移走。6位牛津学生拒绝从大学教堂移走耶稣受难像，因而被送到伦敦塔监禁。多数天主教徒悲哀地服从新规定，也有相当数量的教徒宁愿付出罚金而不愿参加英国国教礼拜。皇家委员会估计英国有5万名“不参加国教礼拜的天主教徒”（1580年）。国教派的主教向政府抱怨民间家庭仍然做弥撒，公众礼拜还杂以天主教仪式，以及新教徒在某些激烈的城市里不安全。伊丽莎白责备大主教巴尔克执行不力（1565年），其后法律更严予执行。在西班牙大使礼拜堂中听弥撒的天主教徒均被下狱；政府搜查伦敦民房；发现陌生者即命其说明其所属的宗教；下令地方法官处罚藏有罗马天主教神学书籍的人（1567年）。
我们不宜通过17世纪和18世纪哲学家及革命赢得的相对宗教宽容来看这些立法。当时各教派互相斗争，受政治影响而更加复杂——宗教宽容的范围受限。16世纪各党派和各国政府均认为宗教意见不同就是一种革命。教皇庇护五世自认经过很长时间的忍耐后才发布教谕（1570年），不但将伊丽莎白驱逐教籍，而且不允许臣民对她忠贞，禁止他们“服从其指示、命令及法律”。法国和西班牙当时想与英国结好，故压制该教谕的传布，但是其中一份教谕却让人秘密地贴在伦敦主教寓所。犯禁者立刻被抓获，处以极刑。面对这种宣战，大臣请求国会制定更严厉的反天主教法律。国会通过法案规定（其间称呼女王为异端、阴谋家、篡位者、暴君），凡传播教皇教谕于英国或使新教徒改信天主教者，均犯死罪。政府授权高级宗教法庭审问所有嫌疑犯，并处罚其违法而未受处罚之罪，包括与人通奸。
欧洲天主教君主无法抗议这些严厉的措施，因为他们自己也采取类似的措施。多数英国天主教徒仍然不抵抗，伊丽莎白政府希望习惯会使他们接受，时间一久会使他们改变信仰。为防止此事发生，一位逃难的英国人威廉·艾伦（William Allen）在当时西班牙属地荷兰的杜埃（Douay），创设一所学院和教士养成学校，专门训练英国天主教徒在英国传教。他热切地表达其目的：
我们最主要的课题是要在天主教徒的心中激起反对异端的热情及正义的愤怒。我们的方法是让学生看清天主教在我们现在住的地方表现的那种特别高贵的礼仪。同时，我们要唤起大家注意家乡那种可悲的对照：一切神圣的事物皆彻底毁灭……我们的朋友和亲属，我们尊敬的人及其他无数的人，均在教派纷争及无神状态中遭到毁灭的命运。监牢和地牢人满为患，监禁的不是小偷和不法之徒，而是基督的教士及其信徒及我们的亲友。我们不应受伤害，也不应旁观我们的国家深陷于痛苦中。
直到1578年加尔文教派攻占杜埃，该校才封闭，然后改设在兰斯，后又迁回杜埃（1593年）。《杜埃圣经》（The Douay Bible）——拉丁《圣经》本的英译本——在兰斯和杜埃（1582—1610年）成稿，“詹姆士王《圣经》本”出版前一年，该版译本才发行。1574年至1585年，该校将275名毕业生封以圣职，并派遣其中268人至英国传教。艾伦奉召至罗马，升任红衣主教，其工作仍然继续进行。续有170名僧侣于1603年伊丽莎白死亡以前，奉派至英国工作。在438名僧侣当中，98名遭受极刑。
英国传教士的领袖地位后来传给耶稣会教士罗伯特·帕尔森，此人热心勇敢，善做神学辩论，也是杰出的散文家。他坦白宣称，教谕已驱逐伊丽莎白，即使她被刺杀也是正当的。许多英国天主教徒感到震惊，但教皇格列高利八世的秘书托罗米奥·加利（Tolomeo Galli）赞成其主张。帕尔森呼吁天主教国家入侵英国，西班牙驻英大使谴责这项计划是“愚昧犯罪”的，耶稣会会长埃韦拉德·梅尔库里恩（Everard Mercurian）于是禁止他干政。但他不为所动，私自决定入侵英国。他化装成自荷兰服役归来的英国军官，其军人威武的神情，其金边外衣及羽毛帽，使他骗过了关卡的守吏（1580年）。他又协助另一位耶稣会教士埃德蒙·坎皮恩（Edmund Campion）化装成珠宝商随他进入英国，之后秘密住在伦敦市中心区。
他们访问了被捕的天主教徒，发现他们并无受虐待的事实。他们广征世俗和僧侣助手，开始鼓励天主教徒继续对教会忠诚，并促使最近改信新教者回头。隐藏在英国的世俗教士，感到这些传教士太过胆大，因而警告他们迟早会被人发现并被逮捕，若为人发现，势必使英国天主教徒的境况更加恶化，所以请求他们返回欧陆。但帕尔森和坎皮恩坚持不肯放弃。他们潜往一个又一个城市，举行秘密集会，听人忏悔，做弥撒，并祝福把他们当作上帝使者的崇拜者。他们抵英一年内——自称——已使2万人皈依。他们建立印刷厂，广事宣传。伦敦街上发现了短文，宣称伊丽莎白在为教皇驱逐出教后已不复为英国的合法君主。另有一位耶稣会教士被派往爱丁堡劝请苏格兰天主教徒自北方入侵英国。威斯特摩兰顺应梵蒂冈（Vatican）的召唤，自罗马带金银无数回佛兰德斯以资助自荷兰入侵英国之举。1581年夏，许多天主教徒均相信，阿尔瓦（Alva）的西班牙军队将越界侵入英国。
受到政府密探的警告，英国政府加紧逮捕耶稣会教徒。帕尔森越过英伦海峡逃生，坎皮恩却被捕（1581年7月），押送时经过同情他的乡村和敌视他的伦敦，被禁于伦敦塔。伊丽莎白指名传唤并想挽救其生命。她问他，他是否承认她是合法君王？他答是。但是对其第二个问题：“教皇逐我出教是否合法？”他却和许多饱学之士一样，都无一致的看法，致使她无所适从。她把他送往伦敦塔，并训令好好看待他。塞西尔命令用刑追查其同谋。经过两天的苦刑，他说出几个名字，接着政府开始一连串的逮捕行动。后来坎皮恩恢复了勇气，向新教神学家挑战，要求公开辩论。经委员会允许，在伦敦塔礼拜堂举行了一场辩论，朝臣、犯人及公众均获允参观。那位耶稣会教士虽双腿疲软，仍然站立数个小时为天主教神学辩护。两方面均无法令对方心服，坎皮恩受审时，其罪名并不是异端，而是阴谋以内乱和外患颠覆政府。他与其他14人被判有罪，1581年12月1日受绞刑而死。
天主教徒正确预测耶稣会的任务会迫使政府采取进一步迫害行动，伊丽莎白将她与那些试图取代其王位者和谋刺者之间的是非诉诸其子民。1581年的国会法律规定：改信天主教者以叛国罪处罚；任何做弥撒的教士应罚200马克并处一年的徒刑；拒绝参加国教礼拜者每月应付20金镑——除了最富有的天主教徒外，任何天主教徒皆会因此破产。不能支付罚金者即予拘捕并没收其财产。不久，监牢里面到处都是天主教徒，许多旧城堡也改为监狱。局面起伏不定，随着玛丽·斯图亚特的即将处死及与西班牙和罗马间的冲突日益激烈而日趋紧张。1583年6月，一名教皇使节向教皇格列高利八世提供了一项由爱尔兰、法国及西班牙三国军队即时进攻英国的详细计划。教皇对于这项计划深表同情，并预先准备了特别的措施。但英国密探已预先得到风声，也有应对的准备，该计划只能搁置。
国会以更富压制性的立法来报复。自1559年6月起受封圣职的僧侣，依然抗命不承认英王最高地位而起誓者，在40天内应离开英国，或以叛逆罪处死，庇护他们者将被绞死。依据该法及其他法律，伊丽莎白在位期间，共有123名僧侣和60名俗人被处以死刑，或许另有200人死于狱中。新教徒抗议这些立法过于严苛，某些人改信天主教。塞西尔之孙威廉逃亡至罗马，向教皇誓死效忠。
多数英国天主教徒反对以暴力对抗政府。其中一派向英王伊丽莎白请愿（1585年），表达其效忠之诚，并请“仁慈地考虑（彼等）遭受的迫害”。但犹如证实英国政府宣布这些措施可由战争获得证明一样，红衣主教艾伦竟发表一篇文章（1588年），试图使英国天主教徒支持西班牙人即将进犯英国的行动。他称女王是“一位乱伦的私生子，是恶名狼藉的妓女在犯罪中所生”，并指责“她……由于难以描述、难以置信的贪欲好淫，对莱斯特及其他人广施色相，滥用其肉体”，要求英国的天主教徒起而反抗这位“不道德、受诅咒、遭受逐籍的异端”，同时允诺任何人只要协助放逐“当代罪恶及厌恶的主要对象”，即可得到永久的赦罪券。英国天主教徒却与新教徒一样，勇敢地抗拒西班牙的无敌舰队。
对抗西班牙获胜以后，迫害继续不停，仿佛是一场无休止的战争中的一部分。1588年至1603年，共有61位僧侣和49名俗人被绞死。12位教士在女王逝世那年向女王提出动人的诉愿，请求准许其留在英国。他们驳斥否定女王继承王位权利的主张，并反对教皇有逐其去位的权利，但是依据良心他们无法承认除教皇以外的任何人为教会的领袖。请愿书在女王死前数天才送到女王手中，其后果如何尚无记载；但在无意之中，包容了两个世纪以后解决问题的各种原则在内。女王死时仍是其执政期间一次最伟大斗争的胜利者，但这次的胜利比以前沾染了更多的污点。