2.1　基因检测的前世今生

血型检验

最古老的基因检测的雏形可以追溯到20世纪初的“血型检测”。自1901年发现血型之后，血型检测就在医学和最初的犯罪现场调查中广泛应用开来。同时，由于父母的血型能够在一定程度上限制了子女血型的可能性，血型检验在一定程度上也能够用来鉴定血缘关系。

早期在犯罪调查中血型检测应用的著名案例

意大利都灵大学的一位教授收到了一份血型检验的请求：一个嫌犯衣服上发现了血迹，检方认为血迹是从死者身上转移而来的，嫌犯则辩称是自己鼻子流血留下的血迹。经过教授检验，死者本身是O型血，而衣服上的血迹是A型，与嫌犯相同，嫌犯最终被证明是无辜的。

间接的标记物或形态学检验

20世纪70年代，以疾病筛查为目的的检测项目开始出现。比如美国在新生儿中开展的苯丙酮尿症（phenylketonuria,PKU）检查。该疾病是一种由酶缺陷所导致的较为常见的一种常染色体隐性遗传性疾病。因Foiling最早发现病人尿中含有大量的苯丙酮酸而得名。该病患儿因为无法将食物中的苯丙氨酸转化为酪氨酸而导致大脑内苯丙氨酸聚集。苯丙氨酸转化后可成为苯丙酮酸，从而影响患儿大脑发育，引起智力障碍和癫痫。但是如果苯丙酮尿症患儿能够早期发现并得到及时正规的治疗，近90%的患儿智力可达到正常同龄儿童，只有少部分患儿由于治疗不够配合或病情较重，血苯丙氨酸浓度控制不理想，可导致智力发育落后。

此外，这个时期检测的疾病还包括镰刀型红细胞疾病、家族黑蒙性痴呆等。这些检测手段都是针对血液中的标记物，如某些蛋白质、化学成分等，或者是针对某些情况下细胞形状的变化进行的。

染色体核型分析

随着技术的进步，出现了染色体水平上的检测项目，如唐氏综合征（由患者体内21号染色体多出一条造成的染色体疾病）的筛查。

DNA指纹分析

到了1984年，英国遗传学家阿莱克·杰弗里斯爵士最早应用DNA指纹分析并发展了DNA特征测定技术。该方法又称为限制片段多态性，它能够利用一种特殊的酶（限制性内切酶）将DNA切成大小不等的片段，由于每个人的DNA都与其他人的多少有些不同，因此切割后的片段长度也不尽相同，可以用来区分不同的个体，其精准性远高于血型鉴定。

英国科林·皮奇福克强奸杀人案

1984年，位于英格兰中部的莱斯特郡，两名少女遭到强暴后被杀害，由于案发地处偏僻，同时现场并未得到较好保护，因而此案未能迅速侦破。后来警方经过调查分析，认定凶手应对现场周围的情况比较熟悉，于是抽取了附近3个村庄所有13～30岁的5000名男子的血样，通过DNA鉴定技术，经分析比较后发现一个名字叫科林·皮奇福克（Colin Pitchfork）的人，他的遗传物质与残留在这两名受害少女体内的精液的遗传物质相符。1987年，27岁的科林·皮奇福克在逍遥法外三年之后，终于被警方捉拿归案，并如实供述了自己奸杀两名少女的犯罪事实。科林·皮奇福克成为第一个利用DNA鉴定技术而被抓获的犯罪嫌疑人，随后，他被判处终身监禁。正是因为DNA鉴定技术在此案侦破中显示出的独特功效，使得人们对这项技术刮目相看，加深了对其的认知程度。自此，DNA鉴定技术在英国以及其他西方发达国家蓬勃发展起来，并越来越多地被应用于刑事侦查活动中。

基因检测的最大催化剂——PCR技术的诞生

早期基因检测的主要瓶颈之一就是在检测过程中往往因为样本量太少而无法提取到足够的DNA。1983年，出现了一项划时代的发明，即PCR技术，该技术可以利用痕量的初始样本经过体外扩增后达到各种检测技术所需要的量。目前可以做到仅用一个细胞就能扩增并测序其基因组（目前科学界热门的单细胞测序）。自该技术发明后，被广泛用于医学、生物学和犯罪学实验室，而其发明者美国化学家凯利·穆利斯因为该发明和加拿大化学家迈克尔·史密斯共同分享了1993年的诺贝尔化学奖。

测序技术大发展

基因是生物体内一道道蕴含“机密”的密码，蕴藏了生物绝大部分遗传信息，人类自发现基因之日起，就希望能够破解它的秘密。基因测序就是要测定未知的序列，确定重组基因的方向与结构，对突变进行定位和鉴定比较的研究。

第一代基因测序技术诞生于1977年，是由美国生物化学家A.M.Maxam和W.Gilbert发明的化学降解法。这种方法仅从化学领域触发，科学家将一个DNA片段的5端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而5端被标记的DNA片段。然后再通过凝胶电泳分离，经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的基因的碱基序列。

同年，英国生物化学家Frederick Sanger发明了双脱氧末端终止法，即至今广泛应用的Sanger测序法。应用这一技术，科学家完成了首次的人类全基因的测序工作。Sanger测序法是用双脱氧核苷酸作为链终止试剂，通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。以该法为基础，Sanger后来对它进行了许多改进，使之更适合实际操作，这为后来的大规模测序提供了技术支持。其中一个重要改进是利用单链DNA噬菌体载体将随机打断的DNA片断分别测序，再拼成完整的基因。

20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术逐步代替了双脱氧末端终止法，这是一种通过使用四种不同的荧光试剂来标记四种双脱氧核苷酸进行DNA测的方法，它的出现将DNA测序技术带入了自动化测序时代。

总的说来，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高、通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。

经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术，Illumina公司的Solexa、Hiseq技术，以及ABI公司的Solid技术为标志的第二代测序技术诞生了。

这种测序技术是在Sanger等测序方法的基础上，通过用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTPp，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTPp就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号，经过特定的计算机软件处理，而获得待测的DNA序列信息。

第二代测序技术大大降低了测序成本，同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性。以前完成一个人类基因组的测序需要3年，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。

2012年11月，大型国际科研合作项目“千人基因组计划”的研究人员公布了1092个人的基因组数据。参与这一项目的科学家用第二代测序技术完成了对世界上主要人群的基因组测序工作，绘制了迄今为止最详尽、最有医学应用价值的人类基因组遗传多态性图谱。然而，读长相对较短仍是第二代测序技术的主要瓶颈。

为了突破这一瓶颈，科学家们继续探索，终于发现了单分子的测序技术。这一技术也被称为第三代测序技术。与前两代不同的是，它基于单分子水平的边合成边测序。第三代的单分子荧光技术多条基因并行的测序方法与第二代相同，但第三代实现了单分子纳米级别的测量。打个比方，DNA就像是漆黑的夜里萤火虫发的光，第二代测序技术无法辨别每一只萤火虫，所以就把上千只萤火虫放在同一个袋子里，才能收集到它们的光。但第三代技术却可以辨别每一只萤火虫，而且可以同时测量很多个DNA片断。

小知识

PCR技术（Polymerase Chain Reaction）：即聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。该技术利用DNA在体外95℃左右高温时变性会变成单链，低温（经常是60℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5′-3′）的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。