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第三节
模型研究方法

一、实验动物的选择

目前用于高血压研究的动物以大鼠、犬、家兔、小鼠等最为常用。在研究两肾一夹法高血压模型时还会用到猴、猪等,急性高血压模型制备时也会用到猫,对于高血压分子机制研究时还会用到基因工程小鼠。

二、观察指标

(一)血压
1.植入式血压测量,分析血压波动性

有全植入式遥测法和血管介入口法(Vascular Access Port,VAP),可监测24小时连续血压,分析血压波动性。长期波动性表示每30分钟之间血压的波动程度,短期波动性表示每30分钟之内血压波动程度。遥感直接血压测定法是血压测量的金标准方法,主要由植入体、接收器、转换器和分析记录系统组成无线遥控系统。植入体是压力感受器和压力信号发射装置,带有充满肝素生理盐水的塑料管。塑料管插入动脉,传导血压;植入体固定于腹壁,以磁性开关控制。植入体采集信号,经无线电发射,由体外接收器远距离接收,经数据转换器转换得血压值。测得的数值稳定、准确,首选用于慢性、持续的血压自动采集。

2.间接血压测量

常用的间接测压法主要有大鼠尾容积测压(Cuff法)及尾动脉脉搏测压法,监测收缩压、舒张压等。脉搏传导时间法间接的血压测定方法,是建立在多种假设和复杂的计算方法上的,而这些假设和计算方法自身还未被实践所证明,因此目前大鼠血压的测定方法以Tail-Cuff法(尾动脉袖套法)为主。可用于小鼠、大鼠、兔子和狗等大小动物血压的监测。动物固定,加热,容积压力传感器套入鼠尾,设定测压循环次数。设置平行测多组大鼠血压可得到抗高血压药的效能、量效关系,多药同等条件下降血压作用对比可以得出药效强度,给药后连续时间点监测大鼠血压得出降血压药的时效关系。

(二)血流动力学

抗高血压药物降低血压是与心功能和血流动力学的改变密切相关的,血流动力学测定法是研究药物对心血管功能影响的常用手段。犬、猫或大鼠为常用动物,一般用麻醉动物,如能在清醒状态下进行,则更接近正常生理指标。常用指标:心输出量(CO)、左室内压(LVP)、左室内压上升下降最大速率(±LV dp/dt max )、左室舒张末期压(LVEDP)。上述各项指标同步记录于多道生理记录系统或其他生物信号记录分析系统,然后根据这些参数再推算血流动力学的二级参数如心脏指数(CI)、心搏指数(SI)、左室做功(LVW)等。一般以+LV dp/dt max 、LVP评价心脏收缩功能,LVEDP和-LV dp/dt max 评价舒张功能,CO、CI评价心脏泵血功能。此外,根据实验要求,可增加肾血流量(RBF)或尿量的测定。

(三)降压相关药效
1.血脂检测

血脂紊乱是高血压发病或影响预后的独立危险因素。给药后取血,测量血清中血脂四项:总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c);监测动态游离脂肪酸(FAA);酶免法测载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B、载脂蛋白E等。

2.血糖检测

高血压病人大多数存在胰岛素抵抗。测量禁食8~12小时后,血糖及胰岛素水平并计算出胰岛素抵抗指数。

3.尿酸检测

禁食8~12小时后,血尿酸(UA)测量;代谢笼收集尿液,测量尿酸。

4.血液流变学检测

高血压发生后常伴有血液流变学改变。测定全血(高、中、低)切还原黏度、血浆(高、中、低)切还原黏度、血浆纤维蛋白原含量、血细胞比容、红细胞沉降率、血小板黏附和聚集性等血流流变学指标,对评价药物的作用具有重要意义。

(四)微循环

不同年龄、不同时期的原发性高血压病均存在不同程度的微循环障碍,实验证实血压与微循环血流量成负相关。应用激光多普勒血流成像技术观察大鼠在体表如动物脏器、皮肤表面(尾部、脸部)宏观组织毛细血管血流量变化;应用动态可视化技术观察大鼠在体肠系膜、肝脏微循环血流速度,综合评价微循环状态。①激光多普勒血流成像技术:能够活体情况下无创伤地观察到动物脏器、皮肤表面宏观组织毛细血管血流量变化。MoorFLPI散斑全帧实时扫描成像系统,动态视频表现血流变化。采用低分辨率扫描,测定大鼠肠系膜、肝脏微循环血流量。②动态可视化技术:该技术是结合荧光倒置显微镜、高速摄像头、超敏摄像头、温控系统等对动物各脏器毛细血管中红细胞在微静脉或微动脉两点距离间的运动速度、微动脉及微静脉收缩、扩张度进行精确量化测量。应用动态可视化技术观察微循环中红细胞、白细胞和血小板状态,并对红细胞进行标记,高速摄像。采用高拍慢放的方法,计算红细胞流速。

(五)降压机制研究
1.肾素-血管紧张素-醛固酮系统

动物给药后,下腔静脉取血,采用放免法及酶免法检测血清中PRA、AngⅡ、ALD、ACE、Ang(1-7)等活性;检测AT 1 mRNA表达、肾素基因、血管紧张素原基因、醛固酮合成酶基因等。

2.钙离子及血管张力

动物给药后,下腔静脉取血,解剖取左心室,左心室心肌匀浆,采用放免法及酶免法检测心肌中钙离子含量、Ca 2+ -ATP酶以及Na + -K + -ATP酶活性;采用膜片钳技术观察对血管平滑肌细胞钾通道和钙通道的影响。离体胸主动脉实验:SD大鼠打开胸腹腔暴露胸主动脉,剪下2~3cm左右的胸主动脉(尽量靠近心端),观察给药前后对KCl、NA引起的血管平滑肌收缩的影响,及探讨其作用是否依赖于细胞内钙与细胞外钙收缩反应等。

3.利尿

采用代谢笼法或输尿管集尿法,观察给药后动物不同时间点的尿量,测定尿液中Na + 、Cl - 、K + 水平。

4.炎症因子

采用免疫组化法检测给药后大鼠血清中白细胞介素 IL-1、 IL-1β、 IL-2、 IL-4、 IL-6、 IL-8、 IL-12等含量,前列腺素E 2 (PGE 2 )和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平。

5.免疫功能

采用酶免法检测给药后大鼠血清抗体IgA、IgG、IgM等水平,测定补体C3、C4水平等。

6.胰岛素抵抗

动物给药后,酶比色法检测大鼠糖耐量;采用酶免法检测大鼠血浆中抵抗素、脂联素、瘦素水平;采用放免法检测大鼠血浆中胰岛素和肿瘤坏死因子α水平。

7.内皮功能

动物给药后,酶比色法检测大鼠血清中NO、ET等。

(六)与高血压相关的分子生物学研究

可以对高血压模型进行蛋白质组学研究,探索不同高血压模型动物不同器官蛋白质表达差异情况、信号转导通路蛋白表达、相关酶基因表达与高血压的关系。

三、动物模型及指标选择

高血压发病机制复杂,防治的途径、方法及药物类型亦较复杂,因而需要进行的中药药效学实验较多。抗高血压中药药效学研究,一般应以整体动物实验为基础,根据受试中药的功能主治、作用特点,结合临床证候与疾病的特征,选择多种不同的动物模型(包括疾病模型、病证结合模型),制定能反映本品的主要临床运用特色和作用特点的研究方案,多方面、多层次阐明药物的作用及其机制。例如:

1.根据所研究高血压的类型及中药功效的特点,选择适当的高血压模型或病证结合模型,通过直接测压法或间接测压法,观察药物的降压效果及血流动力学变化,并可进一步对其中枢性、外周性降压机制及靶器官保护作用机制进行研究。

2.如条件许可,应采用两种以上动物模型相互验证,并需观察单次给药的急性降压作用与多次给药的慢性降压作用,后者疗程多为2周以上。

3.大鼠尾动脉间接测压法可在无创伤条件下多次测压,但需注意室温等。要注明加温的温度和时间,因这些因素等会对血压产生较大影响。

4.以抑制RAAS系统亢进的药物,则主要检测给药后血清及相关组织中PRA、AngⅡ、ALD、ACE含量。

5.以抑制交感神经功能亢奋的药物,减少心输出量药物,则主要进行慢性应激实验,减少交感神经递质释放。还可进行一些反映本品特点的机制研究。

6.以改善血管内皮功能损伤为主的药物,则主要进行人脐静脉血管内皮细胞损伤实验,抑制内皮细胞损害,改善内皮细胞功能,减少NO/ET释放失调。

7.用于代谢性高血压的药物,则应进行慢性饮食诱导高血压动物模型,进行调节血脂,抗氧化,保护内皮等相关药效研究。

8.药效评价及新药研究,一般以治疗性给药为主。急性实验性高血压模型常用于急性实验,由于这种模型时间短,允许预防性给药。但不宜所有实验均预防性给药。口服制剂为加快吸收,可十二指肠给药。慢性模型进行长期给药,观察时效关系和量效关系。

9.证候模型的选择,根据方证相应的中医理论,选择相对应的中医证候模型进行药效研究。比较公认的高血压证候模型有肝阳上亢型,模型大鼠会出现面部烘热、腰膝酸软、躁动不安、眩晕、狂躁易怒等可量化的中医证候。

四、阳性对照药的选择

阳性对照药既可选择化药,也可选用中药。化药作用明确,效果确切,尤其是一些经典药品,可检验实验模型和方法可靠性。常用血管紧张转化酶抑制剂卡托普利等,钙离子拮抗剂硝苯地平等,β受体拮抗剂美托洛尔等。

采用中药阳性对照药时,一般应选择疗效肯定的功能主治相似的作为对照药。对照药应是药典记载或经国家药监局批准生产的中成药。例如痰湿壅盛模型可选择牛黄降压丸,肝阳上亢型可选择天麻首乌片。

对照药剂量应与受试药等效或相当,以便进行比较。同一受试药的不同模型药效学实验可选用不同的阳性对照药。 5CGVGuR6ROpQOAuuBuJC8aRqvYgLQOBzRH/gfwWXSnBuDR4IikgaCxSDlK6iut86

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