实例一　精制冠心方对结扎冠状动脉的大鼠急性心肌缺血的影响 ^［14-16］

【原理】

实验动物在麻醉气管插管人工呼吸下，开胸暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支，建立心肌缺血模型，通过观察心电图、血流动力学、心肌酶活性等变化，观察有活血化瘀功效的精制冠心方对急性心肌缺血模型的影响。

【材料】

1.动物

大鼠，雄性，体重250～300g。

2.器材

电生理记录仪，电动呼吸机，解剖显微镜，冰冻切片机，酶标仪，病理图像分析仪。

3.药品及试剂

精制冠心方，乌拉坦（氨基甲酸乙酯），肝素钠注射液，盐酸利多卡因注射液，依文思蓝（Evans-blue），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），甲醛溶液，超氧化物歧化酶（SOD）测试盒，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），丙二醛（MDA）测试盒，乳酸脱氢酶（LDH）测试盒，一氧化氮（NO）测试盒，大鼠内皮素-1（ET-1）酶联免疫测试盒，大鼠心肌肌钙蛋白T（cTnT）酶联免疫测试盒。

【方法】

1.实验分组及给药

将大鼠随机分为空白组、模型组、硝酸甘油（5mg/kg）组、实验组高剂量（40mg/kg）组、中剂量（20mg/kg）组、低剂量（10mg/kg）共6组，每组8只。各组实验当天各给一次药，硝酸甘油组和药物组腹腔注射不同浓度的药物，空白组和模型组腹腔注射等容量生理盐水。

2.模型建立

给药前大鼠禁食不禁水12小时，给药15分钟后，大鼠20%乌拉坦（0.6ml/100g）麻醉，固定于恒温（37℃）鼠兔解剖台上；分离左股动脉、右颈动脉和气管；进行动脉插管，将含肝素钠液导管插入左股动脉和右颈动脉，导管另一头连接于压力换能器，导入多道生理记录仪描记左心室压、动脉压曲线和心电图，心电图异常者剔除；针状电极插入四肢皮下描记心电图；于环状软骨下1～2mm处剪开气管，接动物呼吸机（频率：90次/分钟，吸呼比为1∶1.5）；剪断第3～5肋，撑开胸腔，镊子撕开心包膜，充分暴露心脏并稳定5分钟；心脏表面滴蘸盐酸利多卡因注射液；用穿有一缝合线的小圆针从左心耳下缘2mm处进针，垂直于左前降支由肺动脉圆锥旁出针，进针深度控制在1.5mm左右，宽度为1.5～2mm，结扎左冠状动脉前降支后迅速关闭胸腔，空白组只穿线不结扎。冠脉结扎成功标志：结扎线远端心肌颜色发绀，心电图表现为S-T段抬高、T波高耸。

3.实验动物取材

造模后3小时，沿腹白线剪开大鼠腹腔；用镊子和棉花将腹腔内脏器拨至两侧，小心分离腹主动脉；5ml注射器取血5ml，于5ml离心管中静置15分钟，以3500rpm离心10分钟，取上清分装于0.2ml离心管中，-80℃冻存备用；取血后，迅速开胸取心脏并染色。

4.检测指标

（1）心电图变化：将针状电极插入大鼠四肢皮下，连接Power-lab生理记录仪并描记心电图，观察记录造模前、造模后（5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时）各个时间点ST值、心率（HR）的变化。

（2）心功能变化：分离大鼠右颈总动脉，结扎线扎紧远心端，动脉夹夹住近心端；眼科剪在中间段上剪一小口，将含肝素钠溶液导管插入右颈总动脉（导管另一端连接压力换能器），松开动脉夹，此时左心室压模块显示颈动脉压力变化曲线；缓慢推进导管并不断转动方向，直至显示正常的左心室压变化曲线，结扎线绑紧以固定导管；观察记录造模前后左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末压（LVEDP）、左心室等容期压力最大变化速率（±dp/dt _max ）等各项心功能指标的变化。

（3）动脉血流动力学变化：分离左股动脉，将含肝素钠溶液导管插入左股动脉（方法同右颈总动脉插管，导管插入深度为2cm左右），连接生理记录仪描记动脉压曲线，观察记录造模前后平均动脉压（MAP）等的变化。

（4）心肌缺血范围及心肌梗死范围测定：采用依文思蓝-TTC双重染色法：大鼠取血后，迅速开胸取心脏；用大鼠灌胃器从主动脉缓慢注入10ml冷PBS溶液冲洗余血，再缓慢注入1%依文思蓝（PBS溶液配制）溶液6ml；剔除血管和脂肪等非心肌组织；保鲜膜包裹于-80℃冷冻15分钟以利于切片；沿房室沟从心尖部将心脏平行切成2mm厚切片；将心脏切片放入1%TTC溶液中（用pH 7.4～7.5的PBS溶液配制），置于37℃水浴中避光染色15分钟，每5分钟摇晃使染色液与心肌充分接触；将染色后的心脏切片于10%福尔马林溶液中固定24分钟；滤纸吸干心脏切片表面福尔马林溶液，按顺序称重、拍照；ImageTool 3.0图像分析软件分析各心脏切片（正常心肌为蓝色，缺血心肌为红色，梗死心肌为白色）；用切片面积求积法分别计算心肌缺血范围和心肌梗死范围。

（5）心肌酶及其他生化指标检察，如磷酸肌酶激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、总超氧化物歧化酶（TSOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）含量，一氧化氮（NO）和内皮素-1（ET-1）含量，心肌肌钙蛋白T（cTnT）含量测定。取冻存血清样本，室温下解冻，解冻同时按测试盒要求配制试剂；按说明书操作步骤。

【结果】

1.心电图变化结果：

结扎冠脉后15分钟后各时间点模型组ST较空白组升高，有显著性差异。造模后各给药组ST较模型组均有降低趋势（与模型组比较，P<0.05），说明中药能使结扎左冠状动脉前降支导致的ST抬高值明显降低（图2-1-5）。

2.血液、心肌酶及血流动力学发生改变。

注意：模型组动脉压下降，左心室压降低，心电图ST段明显抬高

【注意】

①本实验采用结扎左冠状动脉前降支建立大鼠心肌缺血模型，模型组大鼠ST值明显抬高，左心室收缩压（LVSP）降低，左心室舒张末压（LVEDP）升高，左心室等容期压力最大变化速率（±dp/dt _max ）绝对值减小，动脉血压降低，心肌酶释放增多，各项指标显示大鼠心肌缺血模型成功建立。心肌缺血时的心电图特征主要为S-T段抬高及T波改变。S-T段抬高是心肌缺血损伤心电图的特征性表现，可作为急性心肌梗死模型复制是否成功的评判标准。但心电变化随时间会发生变化，随后会发生S-T段下降，降低于正常水平。药物的疗效主要是与模型组比较。②通过心脏N-BT染色观察其对心肌梗死范围，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）等各项血液生化学指标的影响。还可测定NO含量，血清ET含量等其他有关指标。选择测定指标是根据本品作用特点。③在胸腔内结扎左冠脉前降支，使心脏保持在原体位，最大程度减小其他因素对大鼠心脏造成伤害。结扎位置是本模型的关键，结扎部位越靠近左心耳根部，大鼠心肌缺血越严重，模型的死亡率也越高；结扎部位越远离左心耳根部，心肌缺血损伤面积越小，也越难辨别冠状动脉走向，但死亡率降低。故应合理选择结扎位置，既能造成一定程度的心血淤阻证，又能降低模型死亡率。结扎位置为左心耳下缘2mm处最合适。部分大鼠左心室插管后，血压会偏低，需稳定5～10分钟，待血压恢复至正常值方可开胸，否则所测基础值偏低，影响实验结果。大鼠开胸后，应平衡5分钟左右后再行冠脉结扎，且于结扎前将2～3滴利多卡因注射液滴至心脏表面，以降低大鼠心律失常发生概率、大鼠死亡率。④实验方法还可不用气管插管方法进行开胸后，将心脏挤出胸腔，结扎左冠脉前降支。此法易使心脏和大血管遭牵拉或挤压，易致大鼠心律失常等的发生。这种方法要求技术熟练者进行操作。⑤本实验方法如在无菌手术下操作，手术区用青霉素粉，术后缝合伤口并术毕肌内注射青霉素40万单位连续3～5天以预防感染，3周动物存活率达到80%，可用于慢性心肌缺血实验。

【评价】

本实验是在体缺血损伤模型，是急性实验模型，重复性好。也可用于慢性心肌缺血实验。同样方法，可用犬或小型猪实验，是心肌缺血药效评价及新药研究常用的方法。

（江西中医药大学　陈兰英　段萌)

实例二　复方丹参对麻醉犬结扎左冠脉前降支致心脏局部缺血冠脉流量及心肌耗氧量的影响 ^［17］

【原理】

麻醉犬结扎左冠脉前降支致心脏局部缺血，把检测冠状动脉血流仪器的探头用流量计的探头置于心脏冠状动脉测定冠脉血流量。用心导管取冠状静脉窦血液及取颈总动脉血，以血氧测定仪分别测定其血氧含量。根据动静脉氧差，计算其差值为心肌耗氧量。复方丹参是活血化瘀药，可增加冠脉流量，减少心肌耗氧量。

【材料】

1.动物

犬。

2.器材

人工呼吸机，压力换能器，超声多普勒血流计（或电磁流量计），多导生理记录仪，血氧分析仪。

3.药品及试剂

复方丹参（丹参和降香）提取物，戊巴比妥钠溶液（30mg/ml），肝素钠溶液（50mg/ml），生理盐水。

【方法】

1.取体重10～12kg家犬，戊巴比妥钠麻醉（于犬后腿内侧小隐静脉缓慢推注3%戊巴比妥钠30mg/kg），称重，固定，气管插管，连接电动人工呼吸机（呼吸频率16～18次/分钟，潮气量350～550ml）。施左侧第四肋间开胸术[左侧第4、5肋间（扪及心跳最强处）沿第5肋上缘开胸，切口约12cm]，暴露心脏，充分止血，剪开心包，做心包床，再充分暴露心脏左前侧壁。

2.分离左冠状动脉左旋支，放血流量计探头，测定冠脉血流量；分离左冠脉前降支第一分支下方2mm处，除假结扎组只穿线不结扎外，其余各组均穿入两条1号丝线，一期结扎前5分钟，静脉滴入利多卡因2g/kg。一期结扎时将一根直径为1mm的9号针头置于结扎线和血管之间，结扎后将针头抽出，造成血管狭窄；30分钟后，用第二条丝线进行血流阻断的二期结扎，完成模型的制备。右颈外静脉插管至冠状静脉窦，血液回流到右颈外静脉，用于取心脏静脉血测心肌氧。颈动脉插管取血测动脉血氧分压。股动脉插管测定动脉血压。以肢导联观察标准Ⅱ导联心电图并计算心率。上述指标可用多道生理记录仪同步记录。

3.平均动脉压及冠状动脉血流量测定：分别于结扎前、一期结扎10分钟、二期结扎即刻、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟测定并记录。心肌耗氧量测定：结扎前和二期结扎60、120分钟时分别于冠状窦（静脉血）、颈总动脉各取血1ml，测定血氧饱和度，按公式计算各组心肌耗氧量：心肌耗氧量（ml/min，每100g）=冠状动脉血流量（ml/min）×　[动脉血氧（ml%）　-冠状窦血氧（ml%）]　÷100g心肌重量。

（说明：箭头所示左冠状动脉回旋支圆点是测定流量电子探头位置，左冠状动脉前降支第一分支与第二分支间箭头所指圆点为结扎处)。

【结果】

模型组结扎后冠脉流量减少，血压降低。复方丹参可明显增加冠脉血流量，降低心肌耗氧量（表2-1-1）。

与模型组比较， ^* P <0.05， ^** P <0.01

【注意】

①本实验是结扎冠状动脉前降支，造成急性心肌梗死模型，左旋支放置电磁流量计探头测定冠脉流量。现在美国TRITON公司推出SAGE-300型超声多普勒血流计探头（Cuff-E，Φ=2.4mm，20MHz），测定心脏冠脉血流量的方法更加简单，稳定性较好。电磁流量计探头或多普勒探头必须与血管紧密接触，测量结果才能准确，故宜选用合适的探头。心肌耗氧量直接法测定时要熟练掌握冠状静脉窦插管技术，保持导管在冠状静脉窦内正确位置，以保证血流通畅。抽取血量要适度，避免抽取血量过多而造成缺血。氧测定影响因素较多，应注意麻醉、呼吸状态及供氧情况，心肌标本的处理及测氧条件的控制，仪器的稳定性与灵敏性，实验环境温度的变化等，均可影响实验结果。②本实验不结扎冠状动脉，观察在正常动物药物的作用。也可观察结扎再灌对冠脉及心肌耗氧量影响及其他如血流动力学、心电图、生化、心脏定量组织学指标。③关于犬结扎左冠状动脉前降支的位置，结扎位置高低，与缺血面积有关，位置高则缺血面积大。总的要求是每次实验结扎位置都一致。④测定冠脉流量或同时研究结扎或结扎再灌，一般用犬或小型猪。杂种家犬在我国易得，Beagle犬和小型猪比较温顺。小型猪对麻醉药较敏感，麻醉药过量或过快易死亡，心脏易发生室颤。⑤大动物为防止结扎致室颤而死亡，宜分两步结扎，结扎前注射利多卡因。⑥此法还可以同时测量心脏血流动力学指标，其他有关生理生化及形态学指标。

【评价】

本实验反映急性心肌缺血模型下药物的作用，是抗急性心缺血常用的一种动物模型。

（江西中医药大学　陈奇　陈兰英)

实例三　痰瘀同治方（瓜蒌薤白半夏汤合血府逐瘀汤）对冠心病痰瘀互结证小型猪模型的影响 ^{［18，19］}

【原理】

实验以高脂饲料喂养小型猪，通过心导管介入，用球囊拉伤冠脉血管内皮，建立冠心病痰瘀互结证小型猪病证结合动物模型。运用冠状动脉造影结合血管内超声以及虚拟组织成像等技术，观察药物对冠状动脉粥样硬化的演变过程以及内皮组织损伤等的影响，评价研究药物的作用及机制，同时将代表证候的客观指标分级评分，观察药物对中医证候的影响。

【材料】

1.动物

小型猪。雌雄兼用，体重（14.6±2.4）kg。

2.器材

C型壁X光机，人工呼吸机，显微摄像机，切片机，高清晰度显微数码图像分析系统。

3.药品及试剂

高脂饲料（100kg普通饲料中加入：胆固醇2kg，胆盐0.5kg，猪油10kg），辛伐他汀片（正旨平），瓜蒌薤白半夏汤（瓜蒌、薤白、半夏、白酒），血府逐瘀汤（当归、生地黄、桃仁、红花、枳壳、赤芍、川芎、柴胡、桔梗、牛膝、甘草），戊巴比妥钠溶液（30mg/ml），肝素钠溶液（50mg/ml），生理盐水，76%复方泛影葡胺注射液。

【方法】

1.模型建立

以高脂饲料喂养2周，每天900g/只。耳静脉注射戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉后，分离右侧颈总动脉，结扎远心端，置入6F动脉鞘管，从动脉鞘的侧管注入肝素200U/kg。在C型臂X光机透视下，以6F 35L右冠导引导管置于左冠状动脉开口行左冠状动脉造影，观察猪冠状动脉的分布情况，造影后置入交换导丝，将导丝置入冠状动脉前降支（left anterior descending branch，LAD）中部，球囊（Cordis产品，球囊∶管径=1.3∶1）经导丝进入LAD中部，视情况打压8～12个大气压（atmosphere，ATM），持续30秒，反复3次，充气间隙维持球囊压力1～1.5ATM并轻微拉动球囊。撤除导丝、球囊后，再次造影观察LAD扩张情况，撤除导引导管，结扎颈总动脉，伤口清创，局部给予150万U青霉素，无菌缝合，单笼喂养观察，连续心电监护，并继续予高脂饲料喂养8周。

2.实验分组与给药

小型猪按体重分为正常对照组、模型对照组、辛伐他汀片组（0.5mg/kg）、瓜蒌薤白半夏汤组（6g生药/kg）、血府逐瘀汤组（8g生药/kg）、痰瘀同治方组（瓜蒌薤白半夏汤3g生药/kg合血府逐瘀汤4g生药/kg），每组6只。各药物组于术后2天将药物拌于饲料中喂养，每天一次，同时继续给予高脂饲料，连续给药8周，正常对照组给予普通饲料，模型组给予高脂饲料。

【结果】

栝蒌薤白半夏汤、血府逐瘀汤对本实验模型组的冠状动脉内膜增生有明显的防治效果，用药各组血管管腔比动物模型组明显扩大，内膜增生程度明显减轻，药后各治疗组心肌缺血程度较模型组有明显改善，表明传统方药对冠心病心肌缺血缺氧损伤有明显的保护作用。采用计算机图像分析软件测量：总管腔面积（内膜面积+残余管腔面积）、残余管冼腔面积；并计算管腔狭窄率 [（1-残余管腔面积）　/总管腔面积×100%。结果见表2-1-2。模型组冠状动脉管腔狭窄率72%与对照组管腔狭窄率5%相比，差异极显著（ P <0.01），说明模型组管腔明显狭窄。各给药组冠状动脉管腔狭窄率与模型组相比，差异极显著（ P <0.01），说明瓜蒌薤白半夏汤组、血府逐瘀汤组、辛伐他汀片组、痰瘀同治方组冠状动脉管腔狭窄程度明显减轻。本模型还观察了体重、体表心电图，心肌梗死范围，无创血流动力学，心脏超声心动图，血脂，炎性因子，细胞凋亡、细胞自噬等，并以30点体表心电图分级评分代表小型猪痰瘀互结证冠心病证候的主症（胸闷胸痛、胸膈痞满、刺痛固定），以体重指数和进食情况分级评分代表兼症（痰多体胖，纳呆脘胀），以舌下血管分布及舌苔颜色分级评分代表舌象（舌质、舌苔），以无创血流动力学6项指标（心率、心输出量每搏输出量、心脏加速指数、左室做功、外周血管阻力）分级评分代表脉象，进行证候评分。

注：与正常对照组比较， ^# P <0.05， ^## P <0.01模型对照组比较， ^* P <0.05， ^** P <0.01

注：与正常对照组比较， ^# P <0.05， ^## P <0.01模型对照组比较， ^* P <0.05， ^** P <0.01

【注意】

①实验小型猪饲以高脂饮食配合血管损伤可在短期内形成冠心病病变及相关指标变化。但猪冠状动脉侧支循环很少，球囊扩张后易发生血管痉挛和致命心律失常，影响其成功率。②还有用高脂饲料喂养结合垂体后叶素注射造成家兔心肌缺血的 “痰瘀互结证”模型。

【评价】

采用高脂基础上再加血管内膜伤害复合因素造成冠心病痰瘀互结证模型，是研究中药抗心肌缺血作用的一个创新方法，能够从病与证两方面评价中药的作用，更能体现中医辨证论治、病证结合的特点。用现代先进的放射影像学介入技术，在不开胸的状态下经心导管制备心肌缺血动物模型，可以减少动物死亡率。本方法模拟饮食不节，过食肥甘厚味，以致动物脾胃失健，聚湿成痰，在痰浊壅滞的基础上，加损伤血管内膜可致血瘀、胸痹，形成冠心病痰瘀互结证，这与临床的病因病机更接近。

（中国中医科学院西苑医院　刘建勋） ePMJTlhgyFFnjDygTEmGN/SdiS7LQ68Wllp09X1Td6IC/txbyGqtUIN4nhNo/Yne