（一）材料

1. 实验动物

2日龄清洁级SD乳大鼠，购自南京市青龙山实验动物养殖中心。

2. 器材与设备

冰箱（BCD-215KS/252KSA）为中国青岛海尔电器有限公司产品；超净工作台（SW-CJ-1F）为苏州安泰空气技术有限公司产品；二氧化碳细胞培养箱（3111）为美国Thermo Scientific公司产品；光学显微镜（CX21/BH-2）为日本奥林巴斯公司产品；倒置显微镜（CKX41）为日本奥林巴斯公司产品；低速离心机（LD4-2A）为北京京立离心机有限公司产品；电子秤（FA1004N）为上海精密科学仪器有限公司产品；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9245A）为上海一恒科技公司产品；隔水式恒温培养箱（GHP-9160）为上海一恒科技公司产品；免疫荧光显微镜（Axio Cam HRC Imager.A2）为德国蔡司公司产品。

3. 主要试剂

胶原酶Ι、胎牛血清（FBS）、高糖DMEM基础培养基、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BRDU）均购自美国Gibco公司；Hsp110小鼠抗大鼠单克隆抗体购自美国BD公司； β -actin小鼠抗大鼠单克隆抗体购自美国细胞信号转导公司（CST）；罗丹明标记山羊抗小鼠IgG（Goat anti-mouse IgG-TRITC）购自武汉博士德生物技术公司；多聚赖氨酸购自德国Sigma公司；其余普通化学试剂均为国产分析纯。

4. 主要耗材

35mm ³ 细胞培养皿、60mm ³ 细胞培养皿、6孔细胞培养板、50mL离心管均购自美国康宁公司；一次性3mL巴氏塑料吸管购自海门安泰实验器材公司；0.22µL微滤器购自美国Milipore公司。

（二）方法

1. 细胞培养

将16只2日龄SD乳大鼠放入洁净塑料盒中，转入超净工作台内；用镊子夹住一只SD乳大鼠的头部，放入20～50mL 75% 酒精溶液中，消毒30s后取出，左手食指与拇指捏住乳大鼠颈部，小指与无名指固定其尾部，仰卧固定，在其胸部左侧剪开。然后左手稍微用力按压大鼠背部，使其心脏暴露出来，剪取心室，放到预冷的D-hank’s液中；重复上述操作，将16只乳大鼠的心脏全部取出；洗去血液，用镊子撕开心脏，剪碎，转入60mm ³ 细胞培养皿中，每8个心脏需要10倍0.8mL胶原酶Ι浓缩溶液（10mg/mL），4℃消化14h；从4℃取出心肌组织块，在超净工作台中用1mL无菌枪头轻柔吹打7～9次，然后转入50mL无菌离心管中，加入3～6mL含15%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，终止消化；1000r/min离心10min；取出，弃上清，加入15mL含15% FBS的DMEM培养基，重悬细胞，计数。调整细胞数，按照4×10 ⁶ 个/mL铺板，放入37℃二氧化碳细胞培养箱中，培养1h；在细胞贴壁1h后，从37℃二氧化碳培养箱中取出细胞培养皿，在超净工作台中轻轻吹打，然后将含悬浮细胞的培养液转入50mL无菌离心管中，轻轻吹打细胞悬液，混匀，进行细胞计数，以（2.2～2.3）×10 ⁶ 个/mL的量调整心肌细胞密度，加入BRDU（20 µg/mL），按2mL/孔的量加入6孔细胞培养板的孔内，盖盖，标记，放入37℃二氧化碳细胞培养箱中，培养48 h，换液。

2. 试验分组与热应激处理

将心肌细胞分为9组（每组3个重复），分别标记为对照组（0min），热应激10min、20min、40min、60min、120min、240min、360min、480min。试验开始后，立即将8个热应激处理试验组心肌细胞放入42℃二氧化碳培养箱中进行热应激处理。待心肌细胞分别热应激10min、20min、40min、60min、120min、240min、360min、480min后，取出热应激心肌细胞，将热应激心肌细胞培养液保存在1.5mL无菌离心管中，标记；用1mL 0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）洗涤应激细胞，除去死细胞，重复3次；每个细胞孔内加入0.7mL 0.25% 胰酶，消化5～10min，吹脱细胞，然后每个细胞孔内加入0.7mL含5% FBS的PBS溶液终止消化，收集在1.5mL无菌离心管中，2000r/min离心5min，重复2次，弃去上清，-20℃保存备用。

3. 心肌细胞培养液酶活性检测

（1）心肌细胞培养液LDH酶活性检测　从-20℃冰箱冷冻区取出冻存的热应激心肌细胞培养液，于4℃融化。然后按照LDH试剂盒的操作程序检测酶活性，其操作步骤如下。

① 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

② 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

③ 样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

④ 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温培养箱中温育60min。

⑤ 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。

⑥ 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

⑦ 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

（2）心肌细胞培养液CK酶活性检测　从-20℃冰箱冷冻区取出冻存热应激心肌细胞培养液，4℃融化。然后按照CK试剂盒的操作程序检测酶活性，其操作步骤如下。

① 包被：用0.05mol/L的PBS缓冲液（pH7.4）将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/mL，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL，4℃过夜；弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。

② 加样：2000r/min离心细胞培养液20min，取0.1mL加入上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1h；弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。

③ 加酶标抗体：于各反应孔中，加入稀释的酶标抗体0.1mL，37℃孵育1h，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。

④ 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1mL，37℃孵育10～30min。

⑤ 终止反应：于各反应孔中加入0.05mL的终止液，终止反应。

⑥ 在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。

（3）心肌细胞培养液AST酶活性检测　从-20℃冰箱冷冻区取出冻存热应激心肌细胞培养液，4℃融化。然后按照AST试剂盒的操作程序检测酶活性，其操作步骤如下。

① 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔；在酶标包被板上标准品准确加样50 μL/孔，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL（样品最终稀释度为5倍）。

② 温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。

③ 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

④ 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。

⑤ 加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。

⑥ 温育：操作同②。

⑦ 洗涤：操作同④。

⑧ 显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15min。

⑨ 终止：每孔加终止液50μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

⑩ 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15min以内进行。

4. 热应激心肌细胞病理损伤检测

（1）细胞爬片的处理　将20mm×20mm的盖玻片放入包埋盒中，1片/盒，投入含1% 盐酸的70% 酒精溶液中浸泡24 h，取出后，自来水冲洗12 h，单蒸水洗6次，三蒸水洗6次，然后放入底部垫有硫酸纸的180mm ³ 玻璃平皿中，180℃烘烤2 h。在超净工作台中，将0.4mL多聚赖氨酸10倍浓缩液加入到40～80mL无菌去离子水中，混匀，配制成20～40 µg/mL的多聚赖氨酸包被工作液；以3mL/孔的量加入无菌6孔细胞板中，用无菌眼科手术弯头镊子夹住上述无菌洁净盖玻片，放入盛有多聚赖氨酸溶液的6孔细胞板中，再用镊子将盖玻片压入细胞板底部，使盖玻片完全浸入多聚赖氨酸溶液中，于超净工作台或37℃二氧化碳培养箱浸泡30min以上，然后用针头反向弯钩的无菌注射器勾起包被好的盖玻片，使之竖立，镊子夹住，放入无菌去离子水，洗去多余的多聚赖氨酸，最后放入铺有无菌硫酸纸的180mm ³ 无菌平皿中；在超净工作台中紫外线灯下晾干，备用。

（2）细胞爬片 右手握一个200µL的移液器，吸取100µL的高糖DMEM基础培养基，分别在6孔细胞培养板每孔底部中央滴上一滴，用眼科手术镊子夹一片多聚赖氨酸包被好的盖玻片放上，接着用移液器的吸头稍微用力按压盖玻片，排出盖玻片与细胞培养板底部多余的液体，利用液体表面张力的作用使盖玻片紧贴在细胞培养板底部。铺板细胞差速贴壁1h后，用3mL巴氏吸管轻轻吹打细胞培养板中的细胞，使贴壁不牢固的心肌细胞脱落，然后将含有细胞的悬液转入50mL离心管中，进行细胞计数，加入BRDU（20mg/mL）及15% FBS的高糖DMEM细胞培养液，混匀；采用逐点铺细胞法加入心肌细胞悬液，放入二氧化碳细胞培养箱中，37℃培养48h。

（3）细胞固定 热应激处理后，取出6孔细胞板，放入超净工作台中，用针尖反向弯转的注射器勾起细胞爬片并使之竖立，镊子夹住，放入组织包埋盒中，做好标记；放入0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）中，浸泡10min，期间晃动数次，使PBS溶液与包埋盒内盖玻片细胞面充分接触；取出包埋盒，沥干盒内水分，放入95% 的酒精溶液中，脱水10min；取出包埋盒，沥干，放入100% 酒精中，脱水5min；取出包埋盒，在超净工作台内打开包埋盒，吹干盖玻片及包埋盒上的酒精，再盖上盖子，-20℃保存。

（4）苏木精-伊红（HE）染色试验 采用常规HE染色方法，具体步骤如下。①复温：从-20℃冰箱中取出冷冻细胞爬片，放入4℃预冷的0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）中复温30min。②细胞核染色：待细胞爬片恢复至室温后，将其放入苏木精染液中染色1～3min；流水中稍微冲洗5～10s，放入1%盐酸酒精中分化2～8s；流水中冲洗10min。③细胞质染色：将细胞爬片用单蒸水稍微洗一下，放入伊红染色液中染1～3min，流水中洗1～5min。④脱水：将细胞爬片分别放入70%、80%、85%、90%、95%、100%（Ι）、100%（Ⅱ）乙醇溶液中，每个梯度2min，连续梯度脱水。⑤透明：将脱水后的细胞爬片分别放入二甲苯（Ι）、二甲苯（Ⅱ）中。⑥封片：脱水后，在一洁净的载玻片中央滴1～2滴中性树脂，将细胞爬片具有细胞的一面扣在载玻片上，标记，干燥。⑦观察：光镜下观察、拍照。

5. 免疫荧光检测

（1）免疫荧光染色 免疫荧光染色主要包括以下7个步骤。①复温：从-20℃冰箱中取出盛有细胞爬片的包埋盒，放入4℃预冷的0.01mol/L PBS溶液（pH7.4）中，浸泡15min。②透膜：从PBS溶液中的取出上述包埋盒，沥去包埋盒中的水渍，放入含0.5% Triton X-100的0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）中，15min。③封闭：取出包埋盒，沥去水渍；将Parafilm膜裁成50mm×50mm大小，在中间滴入50～100µL含5% BSA的0.01mol/L PBS的封闭液（pH7.4），然后用眼科手术镊子夹住细胞爬片，有细胞的一面向下，扣在封闭液面上，室温封闭30min。④一抗孵育：吸去细胞爬片细胞面上的液体，在50mm×50mm Parafilm膜中央加入50µL的抗大鼠Hsp110的小鼠单抗（1∶100稀释），爬片的细胞面向下，盖在单抗溶液上，4℃过夜。⑤二抗孵育：在0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）中浸泡15min，在50mm×50mm Parafilm膜中央加入50µL抗小鼠山羊血清-TRITC（1∶50稀释），37℃，60min。⑥DAPI染色：去二抗，0.01mol/L PBS溶液（pH7.4）中浸泡15min，在50mm×50mm Parafilm膜中央加入50µL DAPI溶液，避光，10min。⑦封片：在0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）中避光浸泡15min，然后在载玻片上滴上50µL抗荧光猝灭封片剂，爬片细胞面向下，封片。

（2）观察 免疫荧光显微镜下，先用常规光源观察、确定爬片范围，然后开通荧光，关闭明场，打开暗场，将旋钮调整到DAPI观察范围，在10倍物镜下，调整角度，观察细胞核的染色情况，拍照；关闭DAPI键，打开TRITC发光，观察细胞质内Hsp110蛋白的染色情况并拍照。

6. hsp110 mRNA实时PCR检测

（1）引物设计 从NCNI基因库中查找 hsp110 mRNA和 β - actin mRNA，分别为accession BC081945.1和NM_031144.2。利用Primer Premier 5.0软件，根据每一个目的基因mRNA设计特异性引物对，引物序列如下。

hsp110 sense: 5 ' GCGTGGAGCAGATAACA 3 '

hsp110 antisense: 5 ' AAGCAACAGCCGTCTA 3 '

预期PCR产物为198bp。

β-actin sense: 5 ' TGCTCCTCCTGAGCGCAAGT 3 '

β-actin antisense: 5 ' ACGCAGCTCAGTAACAGTCCGC 3 '

预期PCR产物为161 bp。

（2）总RNA提取与反转录

① 细胞总RNA的提取：a. 弃掉细胞培养孔中的培养基，用0.01mol/L PBS缓冲液（pH7.4）洗3次，清除坏死细胞；加入0.75mL Trizol，反复晃动，裂解，用细胞刮板刮擦，转移到1.5mL离心管（DEPC水处理），-20℃保存；b. 从-20℃冰箱中取出冷冻的Trizol细胞裂解液，振荡5s，静置5min；c. 加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，静置10min；d. 高速离心机离心15min，将上清液转移到另一新的1.5mL离心管中（DEPC水处理）；加入异丙醇0.5mL，沉淀细胞总RNA，静置10min；e. 4℃下14000 g 离心10min，弃去上清，加入1.2mL 75%乙醇（DEPC处理去离子水∶乙醇 = 1∶3），轻轻弹击离心管的管壁；f. 4℃下14000 g 离心10min，弃去上清，将离心管管口倒扣在洁净滤纸上，置于超净工作台中15～30min，晾干；g. 加入10～15µL经DEPC处理的去离子水，在RNA贴壁端反复吹洗，60℃水浴10min，促进RNA溶解，-20℃保存。

② 细胞总RNA纯度及浓度的检测：根据核酸检测仪的操作程序，测定细胞总RNA的纯度及浓度。

③ 反转录（RT-PCR）：a. 在PCR管中加入6µL DEPC水，然后加入10µL RNA，加入1µL上游引物，离心机中稍加离心，PCR仪中70℃加热5min。b. 放置在冰盒中，加入其他体系：5×First strand buffer（8µL）、DEPC水（21µL）、dNTPs Mixture（2µL）、RNAsin（1µL）、M-MLV（1µL），共50µL，混匀；放入PCR仪中，循环体系：37℃ 60min，95℃ 10min，检测DNA的浓度，以2µg/管分装。c. 实时PCR：将待测样品DNA、2× SYBR Premix Ex Taq、引物、DEPC处理去离子水混合。体系：待测样品DNA（2µg），2×SYBR Premix Ex Taq（12µL），sense primer（1µL），anti-sense（1µL），无菌去离子水（9µL）；ABI 7300 qPCR thermocycler进行扩增。热循环体系：95℃变性3min，然后95℃变性5s，53℃解链30s，72℃延伸30s，30个循环。每一个循环设立一个不加DNA的阴性对照，2的倍比稀释模板的DNA进行实时PCR扩增，得到两个标准曲线：

目的基因： hsp110 mRNA: Y = -3.299 lg x + 36.19, r ² = 0.998

对照基因： β-actin mRNA: Y = -3.310 lg x + 26.86, r ² = 0.997

目的基因与对照基因的扩增效率基本相等。因此， hsp110 mRNA的量可以用下述公式标定。

hsp110 mRNA 的相对含量= 2- ^ΔΔCt

ΔΔCt = (Ct _{hsp110 mRNA} -Ct _{β-actin mRNA} ) _热应激组 -(Ct _{hsp110 mRNA} -Ct _{β-actin mRNA} ) _对照组

7. Western blot检测

（1）总蛋白提取

① 吸取200～300µL M-PER哺乳动物蛋白裂解提取试剂，放入1.5mL无菌离心管中，加入2～3µL蛋白酶抑制剂，混匀，配制成蛋白裂解工作液。

② 从-20℃冰箱中取出1管（1.5mL离心管）冷冻细胞，室温下复温30min，将上述蛋白裂解工作液加入1.5mL离心管中，轻轻吹打，混匀；或者将上述蛋白裂解液加入6孔细胞培养板的一个细胞孔内，以45°倾角前后推挡6孔细胞培养板，轻柔摇晃20～25min，充分裂解细胞。

③ 用200µL移液器吸头反复吹打细胞培养板底部，将细胞裂解液移入1.5mL离心管中，14000 g 离心10min。

④ 将离心管中的上清液转移到一个新的 1.5mL无菌离心管中，-20℃保存，备用。

（2）蛋白质浓度测定

① 标准曲线的建立：a. 取9个1.5mL离心管，依次标记为1、2、3、4、5、6、7、8、9，分别加入0.9mL、0.8mL、0.5mL、0.5mL、0.5mL、0.5mL、0.6mL、0.5mL、1mL的0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）；b. 取0.1mL BSA加入管1混匀，取0.2mL混合液加入管2混匀，取0.5mL混合液加入管3混匀，取0.5mL混合液加入管4混匀，取0.5mL混合液加入管5混匀，取0.5mL混合液加入管6混匀，取0.4mL混合液加入管7混匀，取0.5mL混合液加入管8混匀；c. 每个标准品设立3个重复，每孔需要工作液0.15mL，故需要配制4.05mL工作液，然后根据公式MA∶MB∶MC = 25∶2∶1，计算MA、MB、MC的量，分别吸取MA试剂2.025mL、MB试剂1.944mL以及MC试剂0.081mL，放入10mL离心管中，漩涡振荡仪上振荡5～10s，室温静置，备用；d. 取一块新的96孔细胞培养板，按照a.中对应标记为1、2、3、4、5、6、7、8、9，分别加入稀释好的150 µL标准样品/孔，设3个平行；e. 加入工作液150µL/孔，混匀，盖上盖子，封口膜密封，37℃反应2h；f. 复温10～15min，酶标仪562nm波长读板，记录数据；g. 根据数据作图，建立标准曲线。

② 样品测定：a. 待测样品稀释，取10µL待测样品于490µL 0.01mol/L PBS溶液（pH7.4）中，漩涡振荡仪振荡5～10s，混匀；取待测蛋白稀释液加入96孔细胞培养检测板中，150µL/孔，设立3个重复；加入工作液，150µL/孔，混匀，封口膜密封，37℃反应2h。b. 复温10～15min，酶标仪562nm波长读板，记录结果。c. 根据标准曲线公式计算待测样品的含量。

（3）蛋白变性 将待测蛋白质样品与6×溴酚蓝蛋白上样缓冲液按照5∶1的比例加入1.5mL离心管中，漩涡振荡仪振荡10～30s，混合均匀，用7号注射器针头在离心管顶端扎一小透气孔，沸水中煮5min，4℃冷却5～10min，备用。

（4）10%浓缩胶及分离胶制备 配制10mL 10%分离胶的配方如下：三蒸水（3.9955mL），30%丙烯酰胺（3.3mL），1.5mol/L Tris（pH8.8）（2.5mL），10% SDS（0.1mL），10%过硫氨酸（0.1mL），TEMED（0.0045mL）；分别将上述试剂（TEMED除外）加入50mL离心管中，漩涡振荡仪振荡混匀；将4.5µL TEMED加入上述混合液中，轻柔混匀，用1mL移液管吸取分离胶溶液，沿着制胶器凹槽玻璃板左侧壁轻柔匀速注入分离胶溶液，当胶面距离薄面玻璃板顶端1.5～2.5cm时，停止加注分离胶，然后同样沿着左侧缓缓加入三蒸水，直至与薄面玻璃板顶端面平行，室温静置40～60min。

配制5mL 5%浓缩胶（积层胶）的配方如下：三蒸水（3.9355mL），30%丙烯酰胺（0.83mL），1.5mol/L Tris（pH8.8）（0.63mL），10% SDS（0.05mL），10%过硫氨酸（0.05mL），TEMED（0.0045mL）；将配制好的5mL浓缩胶混匀，沿着左侧壁缓缓加入浓缩胶溶液，直至与薄面玻璃板平行，然后，立即插入梳子，室温静置40～60min，备用。

（5）电泳 电泳胶凝固后，拔去梳子，自来水洗涤制胶玻璃板外面残存的胶屑，装入电泳槽电极柱上，薄面玻璃板在里面，然后加入新配制的1×电泳缓冲液，静置5min，观察是否漏水；将蛋白质待测样品与6×溴酚蓝上样缓冲液的变性混合物在漩涡振荡仪中混匀，以10～20µg蛋白样品/孔加入待测样品，加好样品后，再加入蛋白质marker，将电极柱放入电泳槽，加入1×电泳缓冲液，接通电源，调整电压，90V电泳2～2.5h。

（6）转膜 电泳完成后，取下电泳板，切去浓缩胶、marker及溴酚蓝之外的胶；裁出比胶稍大的PVDF膜及与胶大小一样的滤纸6张，每3张1叠。将裁好的PVDF膜放入甲醇溶液中浸泡，活化，然后在转膜液中平衡；用镊子夹住胶与滤纸，一起放在海绵垫上，滤纸在下；然后在PVDF膜上放3张浸湿的滤纸，用玻璃棒赶去气泡，放上另一块浸湿的海绵垫，合上。放入转膜中；将转膜电泳槽放入盛有冰块的盒中，接通电源，300mA恒流70～90min。

（7）封闭 转膜结束后，去掉海绵垫、滤纸，查看转膜状况，待目的蛋白完全转到PVDF膜上后，将PVDF膜放入TBST溶液中，摇床上洗涤10min，放入20～40mL含5% 脱脂奶粉的TBST溶液中，自封袋密封，4℃封闭12～16h。

（8）单抗孵育 从4℃冰箱保鲜室取出盛有PVDF膜的自封袋，弃掉封闭液，用吸水纸吸去自封袋表面的水分，用尺子将PVDF膜两侧蛋白质marker 72kDa红色条带对齐，用记号笔做好标记；同样，将PVDF膜两侧蛋白质marker 34kDa蓝色条带对齐，用记号笔做好标记，然后沿标记线裁出含目的蛋白Hsp110及内参蛋白 β -actin的两个膜，放入盛有TBST溶液的玻璃平皿中，摇床上洗涤10min，重复3次；将两个PVDF分别装入自封袋，分别加入小鼠抗大鼠Hsp110单抗［1∶（2000～2500）］及 β -actin小鼠抗大鼠单抗（1∶1000），密封，4℃孵育16～24h。

（9）二抗孵育 单抗孵育完成后，从4℃冰箱中取出自封袋，将PVDF膜放入盛有TBST溶液的玻璃平皿中，摇床洗涤10min，重复3次；将洗涤好的膜分别装入两个自封袋中，分别加入羊抗小鼠-HRP标记二抗［1∶（20000～1000000）］，密封，37℃作用2h。

（10）显色 二抗孵育后，从37℃恒温培养箱中取出，弃去二抗溶液，取出PVDF膜，放入盛放TBST溶液的玻璃平皿中，摇床上洗涤10min，重复3次；取出Super signal west pico化学发光底物试剂盒中的A液与B液，吸取等体积的液体，放入50mL离心管中，漩涡振荡仪混合，配制成发光工作液，将PVDF膜封入自封袋中，加入发光反应液，2mL/膜，避光反应5min；用眼科镊子取出PVDF膜，放置在洁净的滤纸上面，再覆盖另一张滤纸，吸去反应液，终止反应。

（11）成像 将PVDF膜放入LAS4000冷光/生物发光影像分析仪中，自动曝光成像、拍照。

（12）数据分析 将上述图片导入Quantity one 4.6.2分析软件，对蛋白电泳条带光密度进行读取。

8. 统计分析

用SPSS 17.0统计软件包提供的多重比较的单因素分析对热应激处理组心肌细胞的差异进行统计分析。每个试验重复3次，结果以平均值 ± 标准误差（ ±S.E.）表示， P <0.05表示差异显著， P <0.01表示差异极显著。 XW5nJB9/dAD780f8N0fkTn2uIyb0vSnbjsrKDSKDg5xtQe+x2YZGybAPXZ5RmcDq