消化心肌组织在心肌细胞的培养过程中至关重要，主要包括消化酶制剂的种类及消化方式两个方面。目前，消化心肌组织的酶主要有胰蛋白酶、胶原酶Ι、胶原酶Ⅱ等，使用方式上分为胰蛋白酶消化、胶原酶Ι消化、胰蛋白酶与胶原酶Ι联用消化以及胶原酶Ι与胶原酶Ⅱ联用消化；消化方式主要有热消化法（37℃）与低温消化法（4℃）两种。胰蛋白酶价格便宜，对心肌细胞的消化作用迅速、猛烈，容易损伤心肌细胞，导致培养的心肌细胞起搏时间晚，跳动细胞数量少；而胶原酶价格较高，但其对心肌细胞的消化作用缓慢、轻柔，对心肌细胞的损伤较轻，有利于心肌细胞起搏时间早，心肌细胞跳动的数量较多。消化方式方面，热消化法（37℃）可分为二氧化碳细胞培养箱内消化与水浴消化两种，其主要原理是37℃为酶发挥其活性的最适宜温度，作用迅速，耗时短，弊端在于作用迅猛、损伤大。研究人员为了克服热消化法的缺点，开发了循环消化法（刘丹，2006），即在胰蛋白酶消化8～10min时就收取消化液，然后加入新胰蛋白酶继续消化，重复5～8次，将心肌组织消化完全为止。低温消化法利用低温（4℃）条件下酶的消化活性较弱，对心肌细胞损伤较小的特性，从而较好地控制消化的程度，其不足之处是污染概率增加。本试验根据以上酶及消化方式的优缺点，选用了胶原酶与低温消化联合的方式进行心肌细胞的培养，得到了较好的结果。

培养心肌细胞的纯度大于或等于90%时，才能用于试验。故在心肌细胞的培养上，尽可能除去成纤维细胞的干扰很重要。目前，对于心肌细胞培养上成纤维细胞的剔除主要采用差速贴壁与抑制其分裂增殖联合法。据报道，差速贴壁的时间介于60～90min，其中以60min最佳，我们在试验中设立了40～90min共6个试验组，结果表明，40min与60min试验组心肌细胞跳动较多，60min组贴壁的成纤维细胞要多于40min组，60min组应优于40min组；而70min、80min、90min三组成纤维细胞贴壁基本为100%，这说明贴壁除杂效果较好，但是贴壁后起跳的心肌细胞数量较少，这表明随着心肌细胞差速贴壁时间的延长，可能影响心肌细胞的活性。总之，试验结果表明最佳的差速贴壁时间为60min，这与相关文献相一致（王艳慧，2009）。尽管差速贴壁可以将大多数成纤维细胞除去，但是其分裂增殖速度较快，必需添加抑制剂，抑制其裂殖，才能保证培养的心肌细胞用于试验（汪长华，2003），在培养24h后，未添加抑制剂，继续培养48h后，细胞培养孔底部多数是成纤维细胞，这表明在心肌细胞后续培养中，成纤维细胞抑制剂的持续作用尤为重要。目前，成纤维细胞抑制剂主要通过抑制成纤维细胞DNA及蛋白质的合成达到控制其生长的目的，常用的抑制剂主要有BRDU、丝裂霉素C等，其添加时间也不一致，有的文献报道在差速贴壁后24h添加，有的报道在差速贴壁12h添加，也有报道认为在持续添加72h后，不用再添加等（阳海鹰，2010；李润琴，2007）。在本试验中，选用BRDU作为成纤维细胞抑制剂，研究其添加浓度及时间的关系。结果表明，在差速贴壁24h后添加BRDU的效果不佳，原因可能是在24h的生长中，成纤维细胞可以大量裂殖；于是，选取在差速贴壁后直接添加BRDU，在心肌细胞贴壁的过程中直接抑制成纤维细胞的裂殖，同时可能对其贴壁也具有一定的干扰作用，通过对心肌细胞纯度鉴定试验结果表明，这种添加BRDU的方式是较合适的。此外，设定0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L共六个BRDU浓度添加量，比较其对心肌细胞及成纤维细胞的影响，结果表明，随着添加BRDU浓度的增大，细胞培养板内贴壁细胞的数量逐渐稀疏，而且从0.2mol/L组开始，在15% FBS的高糖DMEM培养液中漂浮着大量的死亡细胞，这说明随着BRDU浓度的加大，其对成纤维细胞的毒性作用可能增大；而随着BRDU添加浓度的增大，贴壁细胞数量从90%逐渐降低到65%，起跳细胞的数量差别不大，但是心肌细胞的轮廓逐渐变得模糊，这也表明较大浓度的BRDU对心肌细胞的生长可能具有负面影响。

对于体外培养心肌细胞的活性判断，经常用心肌细胞的跳动频率、跳动细胞数占总细胞的百分比进行评价。在本试验中，影响心肌细胞活性的因素较多，包括选用SD乳大鼠的日龄、胶原酶消化时间的长短、吹打的次数、血清的种类、试验操作技术等各方面因素。SD乳大鼠以2日龄最佳，日龄太小，则大鼠的心脏过小；日龄太大，则心肌细胞的存活不高。一般情况下，在乳大鼠状态较佳时剪取其心脏，用D-hank’s或PBS平衡盐溶液浸泡，置于4℃，根据需要在适宜的时间添加胶原酶，这样可以保证得到状态最佳的心肌细胞；对于血清的选取，应优先选择胎牛血清，因为其内含有较多的生长因子，有利于心肌细胞的贴壁和生长；胶原酶消化的时间为12～16h，尤其以14h最佳，时间太短则细胞难于从组织块脱落，时间过长则对心肌细胞损伤较大。消化后，用1mL移液器吸头吹打，操作应轻柔，吹打次数应控制在10次内，随着吹打次数的增大，跳动细胞的数量逐渐减少，根据实验比较，吹打组织块的次数以8～9次最佳，在相同条件下培养的心肌细胞的活性最好；此外，在差速贴壁前第一次铺细胞及差速贴壁后第二次铺细胞的操作应尽可能快捷，操作时间过长，也会影响体外培养心肌细胞的活性。

心肌细胞不具有增殖能力，因此，心肌细胞铺板的操作对其铺细胞培养板的均匀度具有较大的影响。文献报道主要有两种方法：一种是将含心肌细胞的培养液一次性放入细胞培养皿中，前后左右推挡细胞培养皿，使其混匀；另一种方法是十字铺细胞法，即沿着十字形将含心肌细胞的培养液逐渐滴入细胞培养皿底部。尽管后一种铺细胞的方法较前一种较好，但仍然避免不了心肌细胞堆积贴壁及贴壁不均的发生。在试验的过程中逐点铺细胞的方法被证明较好，即根据细胞培养皿底部面积逐滴加入含心肌细胞的培养液，如此培养出的心肌细胞贴壁非常均匀，心肌细胞堆积的现象也较少见到。

一次大量离体培养原代心肌细胞［细胞总数>（2～5）×10 ⁷ 个］，对心肌细胞的活性及纯度有较大的影响。经过不断的实践探索，我们采用分批循环操作心脏方法，即一个循环仅采取8只乳大鼠心脏，D-hank’s（pH7.4）液洗涤，去除血块、血管等，剪碎，放入盛放7.2mL D-hank’s（pH7.4）溶液的60mm ³ 的细胞培养皿中，轻轻吹散开，4℃储存，然后再重复上述操作，待处理好所有的乳大鼠心脏后，从4℃取出盛放心肌组织的细胞培养皿，同一时间加入胶原酶Ι，混匀，然后再放入4℃冷消化14h。上述方法培养的细胞数量大，细胞均匀度、细胞活性能满足规模较大的试验要求。 wJ6AZ2o0GQ2KcIwciFa8ZwVR57hmOhP1m9ZzGEsSxrfcc6TwhoDw7b1FbQsKrlCx