（一）材料

1. 实验动物

2日龄清洁级SD乳大鼠，购自南京市青龙山实验动物养殖中心。

2. 器材与设备

冰箱（BCD-215KS/252KSA）为中国青岛海尔电器有限公司产品；超净工作台（SW-CJ-1F）为苏州安泰空气技术有限公司产品；二氧化碳培养箱（3111）为美国Thermo Scientific公司产品；光学显微镜（CX21/BH-2）、倒置显微镜（CKX41）为日本奥林巴斯公司产品；低速离心机（LD4-2A）为北京京立离心机有限公司产品；电子秤（FA1004N）为上海精密科学仪器有限公司产品；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9245A）、隔水式恒温培养箱（GHP-9160）为上海一恒科技公司产品；免疫荧光显微镜（AXio Cam HRC Imager.A2）为德国蔡司公司产品。

3. 主要试剂

胶原酶Ι购自美国Gibco公司；胎牛血清、高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司；BRDU、多聚赖氨酸购自德国Sigma公司； α -肌动蛋白小鼠抗大鼠单克隆抗体购自美国ABCAM公司；山羊抗小鼠IgG-TRITC购自武汉博士德公司。

（二）方法

1. 细胞培养

（1）消毒　在超净工作台中，用无菌镊子夹住1只2日龄SD乳大鼠，放入盛有30～50mL 75%医用酒精的小烧杯中，先将其全身浸泡在75%酒精液面下方，浸泡5～10s后，用镊子夹住其头部，使其露出酒精溶液液面，继续浸泡30～40s。

（2）取心脏　消毒完毕后，右手用无菌镊子夹住SD乳大鼠头部皮肤，左手食指与拇指捏住乳大鼠颈部，小指与无名指夹住尾部，使其仰卧固定，待酒精被吹干后，右手执一无菌眼科弯头剪刀，在SD乳大鼠胸骨部左侧靠近腹部的倒数第3～4肋骨处剪开皮肤，然后用剪刀尖头剪开胸部肌肉，开一小口；然后，将剪刀的下方刀刃深入胸腔内，从左向右上方呈弧形剪开胸腔，尽量避免剪破心脏；左手稍微用力按压大鼠颈背部，在胸腔压力的作用下心脏凸露在胸部表面，剪取心室部分，用4℃预冷的无菌D-hank’s（pH7.0～7.4）平衡盐缓冲液浸泡、冲洗。

（3）消化心肌组织　将4℃预冷的无菌D-hank’s溶液分别以2mL/皿的量加入5个无菌35mm ³ 细胞培养皿中，在第六个皿中滴上1～2滴无菌D-hank’s溶液；然后，左手执眼科直头镊子，右手执眼科弯头镊子，将SD乳大鼠心脏放入新的盛放D-hank’s液的35mm ³ 细胞培养皿中，反复按压心脏，使心室中的血液被冲出；用直头镊子固定心脏，弯头镊子轻轻撕去心肌表面的血渍，然后，撕开心室腔隙，查看心室壁上是否有凝血块，用D-hank’s液重复洗涤6次，用眼科手术镊子撕开心肌，使其呈棉絮状，4个或8个心脏为一组，放入无菌35mm ³ 细胞培养皿中，用眼科手术剪剪成直径约0.2mm的颗粒状，用3.6mL或7.2mL的D-hank’s液重悬组织块，然后，将悬浊液体转移到60mm ³ 无菌培养皿中，放入4℃冰箱中储存，备用。在所有试验用SD乳大鼠心脏被取出后，从4℃冰箱中取出储存的心肌组织，在超净工作台中加入10倍胶原酶Ι浓缩液（10mg/mL）0.4mL或0.8mL，进行10倍稀释，然后将盛放心肌组织块的60mm ³ 无菌培养皿放入4℃冰箱内，低温消化12～16h。

（4）细胞铺板　胶原酶Ι消化心肌组织块14～16h后，从4℃冰箱内取出细胞培养皿，放入超净工作台中，观察组织块的消化状况。用配有1mL枪头的移液器轻柔吹打心肌组织块8～10次，然后用3mL一次性无菌巴氏塑料滴管将心肌细胞团悬液转移至50mL离心管中，以8颗乳大鼠心脏需要2mL含15%胎牛血清的DMEM培养基的标准加入50mL无菌离心管，拧紧盖子；在低速常温离心机上离心，1000r/min离心10min；取出，弃上清，加入8mL含15%胎牛血清的高糖DMEM培养基，重悬细胞，计数。调整细胞数，按照6×10 ⁶ 个/mL加入6孔细胞培养板的孔中，2mL/孔；盖上培养板的盖子，将细胞培养板放入二氧化碳细胞培养箱中，37℃培养1h。

（5）差速贴壁　培养1h后，取出，于超净工作台中，用3mL无菌巴氏塑料滴管轻轻吹打6孔细胞培养板的孔中的细胞，使贴壁能力弱的心肌细胞重悬，然后，转移至50mL无菌离心管中，轻轻吹打细胞悬液，取出0.1mL细胞悬液，用0.9mL PBS溶液10倍稀释，加入细胞计数器，光学显微镜下观察，计数；然后以（2.2～2.3）×10 ⁶ 个/mL的标准调整铺板细胞数，并以0.2mmol/L的量加入BRDU，抑制心肌成纤维细胞的增殖，按2mL/孔的标准铺6孔细胞培养板。放入二氧化碳培养箱中，37℃培养48h，换液，继续培养，备用。

2. 形态观察

倒置光学显微镜观察心肌细胞的形态、自律性跳动状态并拍照。

3. 心肌细胞纯度鉴定

（1）盖玻片的处理　分别将20mm×20mm的盖玻片放入组织包埋盒中，1片/盒，盖上盒盖；放入70%酒精（含1%盐酸）溶液中，浸泡24h；取出后自来水连续冲洗12h，再用单蒸水洗6～9次，去离子水洗6～9次；眼科手术弯头镊子夹住洁净的盖玻片平放在底部垫有硫酸纸的180mm ³ 的玻璃平皿中，摆放整齐，避免重叠，80℃干燥2h，然后160℃烘烤2h。在超净工作台中，将0.4mL（10µg/mL）多聚赖氨酸浓缩液加入50mL无菌去离子水中，配制成多聚赖氨酸包被工作液（100µg/mL）；然后以2mL/孔的量加入4块6孔细胞培养板的孔中，然后将上述处理的无菌盖玻片放入多聚赖氨酸包被液中，1片/孔，用眼科手术镊子下按盖玻片，使其浸入液面，浸泡30min以上，用无菌去离子水洗去盖玻片上多余的未包被多聚赖氨酸，水平铺在180mm ³ 无菌平皿底部的硫酸纸上；超净工作台中紫外线灯照射4～6h，风机晾干，最后，放入60mm ³ 细胞培养皿中，封口膜密封，4℃储存、备用。

（2）细胞爬片　在6孔细胞培养板或35mm ³ 细胞培养皿的底部滴一滴高糖DMEM基础培养基，然后用眼科手术镊子夹住一片多聚赖氨酸包被的盖玻片，盖在高糖DMEM溶液上，用移液器的吸头稍微按压盖玻片，排出盖玻片与培养板底部间多余的培养液，使盖玻片紧贴细胞培养板底部，然后盖上细胞培养板的盖子，备用。将胶原酶Ι消化14h的心肌组织块吹打8～10次，1000r/min离心10min，弃去上清，加入适量含15%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基，重悬细胞，加入6孔细胞培养板或35mm ³ 细胞培养皿，2mL/孔，放入二氧化碳培养箱中，37℃培养1h。取出细胞培养板，用3mL无菌巴氏塑料滴管轻轻吹打细胞培养板中的细胞，使贴壁不牢固的心肌细胞脱落；然后，将主要含心肌细胞的培养液移入50mL离心管中，轻轻混匀，细胞计数，加入适量BRDU，调整培养液中的细胞数为（2.2～2.3）×10 ⁶ 个/mL,每个细胞培养孔中加入2mL，放入二氧化碳培养箱中，37℃继续培养。

（3）细胞固定　待心肌细胞培养48～72h后，从二氧化碳培养箱中取出细胞培养板（皿），放入超净工作台中，弃掉细胞培养液，然后以1mL/孔的量加入0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4），轻轻晃动细胞培养板，弃去洗液，重复2～3次；然后，将注射器针头尖反向弯转，轻轻勾起细胞爬片，竖立，用弯头眼科镊子夹住，放入1个组织包埋盒，细胞面向上，合上盖子，同时做好标记。将包埋盒浸入0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）中，浸泡10min；取出，放入70%酒精溶液中，脱水10min；于95%酒精中脱水10min；于100%酒精中脱水5min；取出后放置在超净工作台中吹干，备用。

（4）免疫荧光染色　将备用的组织包埋盒放入含0.5% Triton X-100的0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）中，浸泡15min；取出组织包埋盒，沥干水渍，将Parafilm膜裁成50mm×50mm大小，在膜的中间滴入50µL或100µL含5%BSA的0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4），然后将爬片的细胞面朝向封闭液，覆盖在液面上，室温封闭30min；吸去爬片细胞面上的封闭液体，然后在一张新的50mm×50mm Parafilm膜中央滴上50µL小鼠抗大鼠肌钙蛋白单克隆抗体（1∶100稀释），爬片的细胞面朝向抗体溶液，将爬片覆盖在小鼠抗大鼠肌钙蛋白单克隆抗体液上，4℃孵育16h以上；从4℃冰箱取出细胞爬片，弃掉一抗稀释液，然后将爬片细胞面朝上放入组织包埋盒中，合上盖子，放入0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）中，浸泡15min，期间应轻轻摇动组织包埋盒，使爬片充分与PBS液接触；15min后，取出组织包埋盒，用弯头眼科镊子取出爬片；然后在50mm×50mm Parafilm膜中央加入50µL山羊抗小鼠IgG-四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）二抗稀释液（1∶50稀释），将爬片细胞面朝向二抗稀释，覆盖在上面，放入湿盒中，然后在37℃恒温水浴培养箱中孵育30～60min；从37℃恒温水浴培养箱中取出细胞爬片，弃去山羊抗小鼠IgG-TRITC抗体稀释液，放入组织包埋盒中，再放入0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）中浸泡15min；在50mm×50mm Parafilm膜中央加入50µL 4 ' ,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色溶液，然后，将爬片细胞面朝向DAPI染液，覆盖在上面，避光，孵育10min；用镊子取出爬片，放入一组织包埋盒中，合上盖子，放入0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）中避光浸泡15min；在洁净载玻片上滴上50µL抗荧光猝灭封片剂，取出爬片，细胞面朝向抗荧光猝灭封片剂，覆盖在上面，用镊子轻轻按压爬片，使抗荧光猝灭封片剂分布均匀，阴暗处干燥，备用。

（5）观察　免疫荧光显微镜下，先用常规光源观察、确定爬片范围，然后开通荧光，关闭明场，打开暗场，将旋钮调整到DAPI观察范围，在10倍物镜下，调整角度，观察细胞核的染色情况，拍照；然后，关闭DAPI键，打开TRITC发光，观察细胞质内肌动蛋白的染色情况，拍照。

（6）心肌细胞计数并纯度计算　在荧光显微镜下，随机选取10个视野（100倍放大），拍照。在电脑上计算出一个视野内心肌细胞总数目与视野内的总细胞数目，根据下列公式计算细胞纯度。

心肌细胞纯度 =（视野内心肌细胞总数/视野内总细胞数）×100%

4. 不同BRDU浓度对心肌细胞与成纤维细胞的影响

将30只2日龄SD乳大鼠消毒，取心脏，剪碎，胶原酶Ι消化14h，吹打心肌组织块，1000r/min离心10min，弃上清，加入30mL含15%FBS的高糖DMEM培养液，重悬细胞，将细胞铺入提前放置多聚赖氨酸包被爬片的6孔培养板中，2mL/孔，二氧化碳细胞培养箱中37℃培养1h；取出细胞，3mL巴氏滴管轻轻吹打贴壁细胞面，将细胞悬液转入1个50mL离心管中，细胞计数，调整细胞数，然后以2mL/孔的量铺在已经放置细胞爬片的6孔细胞培养板中；根据设定的0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L浓度，在心肌成纤维细胞培养孔中加入BRDU，设立对照；同样，在心肌细胞培养孔中分别加入上述浓度的BRDU，放入二氧化碳培养箱，37℃培养72h，观察，并收获细胞。

5. 不同差速贴壁时间对心肌细胞的影响

将30只2日龄SD乳大鼠消毒，取心脏，剪碎，胶原酶Ι消化14h，吹打心肌组织块，1000r/min离心10min，弃上清，加入30mL含15%FBS的高糖DMEM培养液，重悬细胞，计数，将细胞铺入提前放置多聚赖氨酸包被爬片的35mm ³ 细胞培养皿中，2mL/孔，放入二氧化碳细胞培养箱中，37℃培养，分别在培养40min、50min、60min、70min、80min、90min后取出，转入50mL离心管中，加入BRDU，调整其浓度至0.2mol/L，铺在放置细胞爬片的新35mm ³ 细胞培养皿中，于二氧化碳细胞培养箱中继续培养至72h。

6. 不同铺板细胞数对细胞贴壁率的影响

将20只2日龄SD乳大鼠消毒，取心脏，剪碎，胶原酶Ι消化14h，吹打心肌组织块，1000r/min离心10min，弃上清，加入12mL含15%FBS的高糖DMEM培养液，重悬细胞，将细胞铺入提前放置多聚赖氨酸包被爬片的6孔培养板中，2mL/孔。放入二氧化碳细胞培养箱中37℃培养1h，取出细胞，3mL巴氏滴管轻轻吹打贴壁细胞面，将细胞悬液转入1个50mL离心管中，细胞计数，铺板细胞数分别设定为1.5×10 ⁶ 个/mL、2.0×10 ⁶ 个/mL、2.3×10 ⁶ 个/mL、2.5×10 ⁶ 个/mL四个铺板浓度，调整细胞数，然后以2mL/孔的量铺在已经放置细胞爬片的6孔细胞培养板中，将细胞放入二氧化碳细胞培养箱中，37℃培养72h，观察、收获细胞。

7. 心肌细胞铺板数与吸光值之间的关系

（1）心肌细胞的培养及铺96孔细胞培养板　将12只2日龄SD乳大鼠消毒，取心脏，剪碎，胶原酶Ι消化14h，吹打心肌组织块，1000r/min离心10min，弃上清，加入12mL含15%FBS的高糖DMEM培养液，重悬细胞，加入6孔培养板中，2mL/孔。二氧化碳细胞培养箱中37℃培养1h，取出细胞，3mL巴氏滴管轻轻吹打贴壁细胞面，将细胞悬液转入1个50mL离心管中，细胞计数，调整细胞数至2×10 ⁶ 个/mL，取8mL细胞放入6孔板的4个孔内，2mL/孔，其余10mL细胞进行2的倍比稀释，其稀释浓度分别为2×10 ⁶ 个/mL、1×10 ⁶ 个/mL、5×10 ⁵ 个/mL、2.5×10 ⁵ 个/mL、1×10 ⁵ 个/mL、5×10 ⁴ 个/mL、2.5×10 ⁴ 个/mL、1×10 ⁴ 个/mL、5×10 ³ 个/mL 9个标准，以0.2mL/孔加入96孔细胞培养板，每个浓度12个孔，将细胞放入二氧化碳细胞培养箱中，37℃培养72 h，观察。

（2）心肌细胞贴壁数量试验　心肌细胞在37℃二氧化碳细胞培养箱中培养72h后，取出，弃去细胞培养液，每孔加入1mL 0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4），轻轻前后推挡6孔细胞培养板，弃掉PBS，重复2～3次；然后每个细胞孔内加入1mL 0.25%胰酶，消化心肌细胞，室温消化4～7min，用3mL巴氏滴管轻轻吹打细胞，使之脱落，待细胞全部脱落后，加入0.5mL含15%的高糖DMEM培养液，终止胰酶的消化；转入1.5mL离心管中，1000r/min离心10min，弃掉上清；用1mL 0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）重悬细胞，取0.1mL心肌细胞悬液加到0.9mL0.01mol/L的PBS溶液（pH7.4）中，混合均匀，取0.3～0.5mL细胞悬液加入计数板中，光学显微镜下100倍放大观察，计数。

（3）MTT试验　取出分装好的MTT浓缩液，融化，取出2.73mL加入27.37mL高糖DMEM培养基中，混匀，配制成10%的MTT溶液；将96孔板中的细胞培养液弃去，然后以0.2mL/孔加入MTT工作液，于二氧化碳细胞培养箱中，37℃继续培养4h；在超净工作台内放置一小磁盘，盘内垫上3～5张滤纸，然后将96孔细胞培养板倒扣在滤纸上，弃掉MTT工作液，然后以0.2mL/孔的量加入二甲基亚砜，摇床摇动15min；酶标仪检测（检测波长为570nm），记录结果。

8. 统计分析

用SPSS 17.0 统计软件包提供的多重比较的单因素分析对热应激组与试验中的差异进行统计分析。每个试验重复3次，结果以平均值±标准误（ ±S.E.）表示， P <0.05表示差异显著， P <0.01表示差异极显著。 lzF+C8kNKmQ3gaKNbHdDfRbNxcNAkz8FTiPz3WejIkfz9XHHNHJwCibRymQmab69