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第二节
家禽寄生虫病的虫种鉴定技术

一、蠕虫病的实验诊断技术

家禽常见的蠕虫包括吸虫、绦虫和线虫三种。

由于蠕虫病的症状缺少特异性,因此仅靠临床症状很难对家禽蠕虫病做出肯定的诊断,而在很大程度上依赖于实验室的检查。

一个正确的诊断,必须对病禽的全身情况进行全面、综合地分析和考虑。实验室检查时,虫卵等的发现,只能说明该受检禽体内已有某种寄生虫的寄生,但它是否是受检禽呈现疾病的主要原因,则还需要根据对本病的流行病学、临床症状、病理变化等各方面作综合的分析和判断。

此外,因蠕虫幼虫所引起的疾病和一些用虫卵或幼虫检查法检出率比较低的寄生虫病,在诊断时还常采用一些免疫诊断的方法,但此类方法尚在发展阶段,还在不断地改进和充实中。

大部分家禽蠕虫寄生于消化道(如棘口吸虫、绦虫、蛔虫),它们的虫卵、幼虫和某些虫体或虫体断片通常和粪便一同排出;少数寄生于呼吸道(如比翼线虫和美丽筒线虫)和输卵管中(如前殖吸虫)的蠕虫,它们所产出的虫卵,也大部分通过粪便排出。因此粪便检查法是诊断家禽蠕虫病的主要方法。本书仅简单介绍这种方法。

检查时所采用的粪便材料一般尽可能取新排出的,这样可以使虫卵保持固有的状态。

(一)肉眼观察法

有些蠕虫虫体可用肉眼观察进行检查,目的在于从粪便中发现整个虫体或节片。在消化道内寄生的绦虫常以含卵节片(孕卵节片)整节排出体外。此外,有时一些蠕虫的完整虫体也可因寿命或驱虫药的影响等原因而排出体外。如鸡绦虫病,可发现病鸡粪便中有白色粟粒样片状虫体,刚排出时能伸缩和蠕动。

粪便中的节片和虫体,其中较大型者,很容易被发现,对较小的,应先将粪便收集于盆(或桶)内,加入5~10倍的清水,搅拌均匀,静置待自然沉淀,而后将上层液体倾去。重新加入清水,搅拌沉淀,反复操作,直到上层液体清澈为止。最后将上层液倾去,取沉渣置大玻皿内,先后在白色背景和黑色背景上,以肉眼或借助于放大镜寻找虫体,有所发现时,用铁针或毛笔将虫体挑出供检查。

(二)虫卵检查法

蠕虫虫卵检查法,目的在于从粪便中发现虫卵,如大多数的吸虫、绦虫和线虫等。又分涂片检查法和集卵法。

1.直接涂片检查法

此法是最简便和常用的方法。但检查时被检的粪量少,检出率低。因此,本法只能作为辅助的方法,并且每次检查至少观察8~10张涂片,才能收到确切的效果。

在洁净的载玻片上滴加1~2滴50%甘油生理盐水,再用牙签、镊子或火柴棍挑取少量粪便加入其中,与甘油生理盐水混匀,夹去较大的或过多的粪渣,最后使载玻片留有一层均匀的粪液,其浓度的要求是将此玻片放于报纸(或书)上,以通过粪液膜能模糊地辨认其下的字迹为宜。在粪膜上覆以盖玻片,置显微镜下检查,检查时先在低倍镜下顺序查找,发现虫卵,再换高倍镜仔细观察。如无甘油生理盐水时,可以用常水代替,加甘油可使标本清晰,易于观察,并防止粪膜过快蒸发变干。但是检查原虫的滋养体,必须以生理盐水进行稀释,不应加甘油,否则会影响其运动而妨碍观察。

2.集卵法

本法总的原则是利用各种方法,将分布在粪便中的虫卵集中起来,再行检查,以提高检出率。所采用的方法一般有两种类型:一是利用虫卵和粪渣中其他成分的密度的差别将其集中,如漂浮法;二是筛滤,即利用孔径大小不同的金属筛过滤粪液,目前常采用260目的锦纶筛兜过滤粪液,过滤时大部分虫卵被留于筛上,然后取筛内物检查,如沉淀法。

以上述两种方式为基础,已有多种具体的方法被采用,较常用的有如下数种。

(1)沉淀法 取粪便5克,加清水100毫升以上,搅匀成粪液,通过40~60目铜筛过滤,滤液收集于三角烧瓶或烧杯中,静置沉淀20~40分钟,倾去上层液,保留沉渣,再加水混匀,并沉淀,如此反复操作直到上层液体透明后,吸取沉渣检查。适于检查吸虫卵。

(2)漂浮法 又称费勒鹏法。本法的基本原理为采用相对密度比虫卵高的漂浮液,使虫卵上浮于液体的表层,形成一层虫卵液膜,然后沾取此液膜进行镜检。此法简便有效,在兽医临床上被广泛用于线虫卵、绦虫卵及球虫卵的检查,但对于吸虫卵、后圆线虫卵及棘头虫卵,则由于它们的相对密度大于饱和食盐水,故效果不理想。其操作步骤如下。

先配制饱和食盐水溶液,配制时先将水烧开,然后加入食盐搅拌,直到不再溶解生成沉淀为止(1000毫升水中约加食盐380克),溶液用双层纱布或棉花过滤,待凉后即可使用(凉后的溶液中,如出现食盐结晶,则表明该溶液是饱和的,合乎要求,其相对密度为1.18)。

取粪便5~10克,置于100~200毫升的烧杯中,先加少量饱和食盐水,把粪便混匀,然后再加约为粪便12倍量的饱和食盐水,并搅拌均匀,通过60目铜筛或纱布滤入烧杯中,静置半小时,则虫卵上浮;用一直径5~10毫米的铂金耳或铁丝圈与液面平行接触以沾取表面液膜,抖落于载玻片上,加盖玻片检查,也可将此滤液直接倒入试管内,补加饱和食盐水使试管充满,加上盖玻片(盖玻片与液面完全接触,不能留有气泡),直立半小时后,取下盖玻片,覆于载玻片上镜检,可收到同样效果。

为了提高漂浮法的检出率,可用硫代硫酸钠饱和液(1750克硫代硫酸钠溶于1000毫升水中,其相对密度为1.4左右)、硫酸镁饱和液(920克硫酸镁溶于1000毫升水中,其相对密度为1.294)、糖饱和液等来代替饱和食盐液。但需注意,如溶液的相对密度过大,则粪便其他成分也随虫卵浮在液面上,影响检出率。有时相对密度加大同时出现黏稠度增加,使虫卵浮起的速度减慢。

使用漂浮法进行虫卵检查时,需要注意以下问题。

①盐类饱和液必须保存在不低于13℃的情况下才能保持较高的相对密度。

②操作中粪便不能互相污染,使用过的工具必须消毒或另换工具才能检查第二个粪样。粪便不能搞错,特别在大面积普查工作中,每次检查都要有详细的记录,粪球要求新鲜,防止暴晒、腐败而失效。

③镜检时一定要详细观察,严格区别虫卵与非虫卵。

(3)锦纶筛兜集卵法 取粪便5~10克,加水搅匀,先通过40或60目的铜丝筛过滤;滤下液再通过260目锦纶筛兜过滤,并在锦纶筛兜中继续加水冲洗,直到洗出液体清澈为止;而后挑取兜内粪渣做抹片检查。此法适用于宽度大于60微米的虫卵,通过以上处理,粗大粪渣被铜筛扣留,纤细粪渣(直径小于40微米)和可溶性色素均被冲洗走而使虫卵集中。

(三)虫卵计数法

虫卵计数法是测定每克禽粪便中的虫卵数,而以此推断禽体内某种寄生虫的寄生数量,有时尚以使用驱虫药前后虫卵数量的对比,以检查驱虫效果。虫卵计数的结果,常以每克粪便中虫卵数表示,目前常用的方法有如下几种。

1.斯陶尔氏法

在一小玻璃容器上(如小三角烧瓶或大试管)容量56毫升和60毫升处各做一个标记。先取0.4%的氢氧化钠溶液注入容器内到56毫升处,加入被检粪便使液体升到60毫升处,再加入一些玻璃珠,振荡使粪便完全破碎混匀;而后在混匀的情况下以1毫升的吸管吸取粪液0.15毫升,滴于2~3张载玻片上,覆以盖玻片,在显微镜下循序检查,统计其中的虫卵总数(注意不可遗漏和重复)。因0.15毫升粪液中实际含原粪量是0.15×4/60=0.01克, 因此所得虫卵总数乘100即为每克粪便中的虫卵数。本法适用于大部分蠕虫卵的计数。

2.麦克马斯特氏法

取粪便2克,放于乳钵中,先加水10毫升,搅匀,再加饱和盐水50毫升。混匀后,吸取粪液,注入计数室,置显微镜台上,静置1~2分钟。然后在镜下计数1平方厘米刻度中的虫卵总数;求两个刻度室中虫卵数的平均数,乘以200即为每克粪便中的虫卵数。本法只适用于可被饱和盐水浮起的各种虫卵。

(四)各种蠕虫虫卵的一般构造

1.线虫卵的一般特征

形状、大小各不相同,一般呈椭圆形或近似圆形;大多数虫卵的外形是对称的,卵壳多由四层膜组成。最外一层卵壳膜多数是平滑的,有的有结节,有的有小凹陷等。内含有多个细胞或一个已发育的幼虫,多为无色,透明,有些呈白色、褐色或黄褐色。

2.吸虫卵的一般特征

多呈卵圆形或椭圆形,大小不一,卵壳由数层膜组成,厚而坚实。大部分吸虫卵的一端有一小盖卵,内含有许多卵黄细胞及一个胚细胞,或含有一个已成形的毛蚴,常呈黄色、黄褐色和褐色。

3.绦虫卵的一般特征

圆叶目绦虫卵多呈三角形、立方形或近似圆形,大小不一,外层膜多较厚,内有一个特殊的梨形器,梨形器内包含有一个六钩蚴,多为无色,少数为黄色或黄褐色。

假叶目绦虫卵近似吸虫卵。

4.虫卵与非虫卵的区别

(1)虫卵 都有一定的卵壳结构,并且都有一定的形状,如圆形、椭圆形,三角形等,多数都是两侧对称的,内含有卵细胞或一个已发育的幼虫或毛蚴。

(2)非虫卵 在粪便中容易与虫卵相混淆的杂物有各种植物细胞、花粉颗粒、脂肪球气泡、真菌孢子、螨类及其卵、纤毛虫、体细胞、结晶等。但这些物质由于种类不同,其形状、大小、颜色也各不相同。如各种植物细胞,有的呈螺旋形,有的呈双层环状物,也有的呈铺石状。但都有明显的细胞壁,与虫卵结构显然不同。各种花粉颗粒多带有一定的颜色,易误认为蛔虫卵,但花粉颗粒没有卵壳的构造,表面呈网状或锯齿状,仔细观察,可以区别。脂肪球和气泡之类,亦很像虫卵。但脂肪球和气泡往往大小不一,无色,且折光性很强,周围壁很厚,而内部是空虚的,不具有虫卵的一般结构。总之,粪渣中与虫卵易混淆的杂物较多,但只要掌握虫卵的构造和特征是可以辨认的。有时某物与虫卵分辨不清,也可用解剖针轻轻推动盖玻片下的东西滚动,这样往往可以把虫卵和其他物体区别开来。

二、螨病的实验诊断技术

(一)病料的采取

禽螨主要有膝螨、鸡皮刺螨、奇棒恙螨等,大多寄生于家禽的体表。因此,可刮取皮屑,置于显微镜下,寻找虫体或虫卵。

刮取皮屑时,应选择患病皮肤与健康皮肤交界处,这里的螨较多。鸡突变膝螨多寄生在鸡的脚上,应刮取鸡脚患部痂皮。刮取前先拔毛,取凸刃小刀,在酒精灯上消毒,用手握刀,使刀刃与皮肤表面垂直,刮取皮屑,直到皮肤轻微出血为止。在野外工作时,为了避免风将刮下的皮屑吹去,可根据所采用检查方法不同,在刀上先蘸一些水、煤油或5%的氢氧化钠溶液,这样皮屑就黏附于刀上,将皮屑收集于平皿内即可带回实验室检查。

(二)检查方法

1.直接检查法

在没有显微镜的条件下,可将刮下的干燥皮屑放于平皿或黑纸上,在日光下曝晒或用热水或炉火等对皿底或黑纸底面给以40~50℃的加温,这时可看到白色虫体在黑色背景上移动。此法仅适用于体形较大的螨。

2.显微镜直接检查法

刮下的皮屑少许,放于载玻片上,滴加煤油或甘油水,加盖玻片后置显微镜下检查。

煤油有透明皮屑的作用,使其中的虫体易被发现,但虫体在煤油中容易死亡;如欲观察活螨,可用10%氢氧化钠溶液、液体石蜡或50%甘油水溶液滴于病料上,在这些溶液中,虫体短期内不会死亡,可观察到其活动。

3.虫体浓集法

为了在较多的病料中检出其中较少的虫体,从而提高检出率,可采用此法。先取病料置于大试管内,加入10%氢氧化钠溶液浸泡过夜或于酒精灯上煮沸3~5分钟,使皮屑溶解。而后待其自然沉淀或离心沉淀(以每分钟2000转的速度离心沉淀5分钟),虫体即沉于管底,弃上层液,吸取沉渣,制成涂片镜检。

4.温水检查法

将病料浸于40~45℃的温水里,置恒温箱中,1~2小时后,将其倾入表面玻璃上,解剖镜下检查。活螨将在温热的作用下,由皮屑内爬出,集结成团,沉于水底部。

5.培养皿内加温法

将刮取到的干的病料,放于培养皿内,加盖。将培养皿放于盛有40~45℃温水的杯上,经10~15分钟后,将皿翻转,则虫体与少量皮屑黏附于皿底,大量皮屑则落于皿盖上。取皿底检查;皿盖可继续放在温水杯上,再过15分钟后,仍可能有虫体黏附于皿盖底部,并可以反复进行如上操作。本法可在镜下收集到与皮屑分离的虫体,供制作玻片标本用。

如欲判断收集到的虫体是否存活(特别是在药物治疗后判断疗效),可采用以上的1、4、5方法,看它们是否活动;也可以将收集到的虫体用油镜观察,活的虫体可见其内部淋巴包含物的流动。

三、原虫病的实验室诊断技术

寄生于动物的病原原虫,根据其寄生部位不同,可分为血液原虫(如禽住白细胞原虫)、消化道原虫(如禽球虫、滴虫等)、组织原虫(如鸭隐孢子虫),它们的病料采集与检查方法也各有不同。

(一)血液内原虫的检查

用消毒过的针头刺破鸡冠,直接采取血液。此法适用于检查寄生于血液中的禽住白细胞虫。血液采取后可用姬氏染色法或瑞氏染色法检查。

采血,滴于载玻片一端,按常规推制成血片,并使晾干。滴甲醇2~3滴于血膜上,使其固定,尔后用姬氏或瑞氏液染色。染后用油浸镜头检查。本法适用于各种血液原虫。

1.姬氏染色法

取市售姬氏染色粉0.5克,中性纯甘油25.0毫升,无水中性甲醇25.0毫升。先将姬氏染色粉置研钵中,加少量甘油充分研磨,再加再磨,直到甘油全部加完为止。将其倒入60~100毫升容量的棕色小口试剂瓶中;在研钵中加少量的甲醇以冲洗甘油染液,冲洗液仍倾入上述瓶中,再加再洗再倾入,直至25毫升甲醇全部用完为止。塞紧瓶塞,充分摇匀,尔后将瓶置于65℃温箱中24小时或室温内3~5天,并不断摇动,此即为原液。

染色时将原液2.0毫升加到中性蒸馏水100毫升中,即为染液。染液加于血膜上染色30分钟,后用水洗2~5分钟,晾干,镜检。

2.瑞氏染色法

以市售的瑞氏染色粉0.2克,置棕色小口试剂瓶中,加入无水中性甲醇100毫升,加塞,置室温内,每日摇4~5分钟,1周后可用。如需急用,可将染色粉0.2克,置研钵中,加中性甘油3.0毫升,充分摇匀,然后以100毫升甲醇,分次冲洗研钵,冲洗液均倒入瓶内,摇匀即成。

瑞氏染色法染色时,血片不必预先固定,可将染液5~8滴直接加到未固定的血膜上,静置2分钟(此时的作用是固定),其后加等量蒸馏水于染液上,摇匀,过3~5分钟(此时为染色)后,流水冲洗,晾干,镜检。

(二)粪便内原虫检查法

多用于禽球虫卵囊、组织滴虫的检查。

一般情况下,检查禽球虫卵囊时,采取新排出的粪便或肠壁刮出物;检查组织滴虫时,刮取盲肠内容物,按蠕虫虫卵检查的漂浮法检查;或直接做成抹片检查;或经过浓集法处理后检查。

球虫卵囊可以染色后观察,先将附有卵囊的抹片,在加温的醋酸中放5~10分钟后固定,而后以0.1%的占纳司绿染色10分钟,在水中洗涤,再以浓的伊红染液染色5分钟,最后再用水洗后检查。

(三)组织内原虫检查法

一般情况下,检查隐孢子虫如鸭隐孢子虫时,可刮取法氏囊、泄殖腔或呼吸道黏膜做成涂片,用姬姆萨染色后镜检,即可见虫体胞浆呈蓝色,内含数个致密的红色颗粒。 AWVcRAxC9GLtO39+we9g5iD0nQRQOAR8BdMmSkimWbsTdnjcCqEnCN5Oq+/l4p96

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