(1)还原物质(OIV-MA-AS311-01A) 还原物质包括所有具有酮和醛功能的糖,通过它们对铜盐碱性溶液的还原作用进行测定。
样品澄清,用下列两种试剂之一处理葡萄酒:中性醋酸铅,亚铁氰化锌(Ⅱ)。
(2)葡萄糖和果糖(OIV-MA-AS311-02) 可用酶分析法分别测定葡萄糖和果糖,其唯一目的是计算葡萄糖/果糖比率。
在己糖激酶(HK)催化的酶促反应过程中,葡萄糖和果糖被三磷酸腺苷(ATP)磷酸化,生成6-磷酸葡萄糖(G6P)和6-磷酸果糖(F6P):
在磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)的作用下,6-磷酸葡萄糖首先被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADP)氧化成6-磷酸葡萄糖酸,生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的量与6-磷酸葡萄糖的量相对应,并与那部分葡萄糖的量相对应。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的量可通过它在340nm的吸光度来测定。
反应结束时,6-磷酸果糖在磷酸葡萄糖异构酶(PGI)的作用下转化成6-磷酸葡萄糖。
6-磷酸葡萄糖再次与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应,生成6-磷酸葡萄糖酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,然后测定后者。
(3)糖(OIV-MA-AS311-03) 适用范围:推荐一种以高效液相色谱法测定酿酒葡萄汁和葡萄酒中果糖、葡萄糖和蔗糖的方法。
用HPLC直接测定糖和甘油,通过折射率进行检测。
(4)稳定酿酒葡萄汁以检测蔗糖添加(OIV-MA-AS311-04) 用氢氧化钠溶液使样品达到pH值为7,添加等体积的丙酮,通过蒸馏去除丙酮,再用TLC(薄层色谱法)和HPLC(高效液相色谱法)测定蔗糖(见蔗糖章节)。
(5)应用核磁共振(SNIF-NMR/RMN-FINS 1 )测定葡萄汁、浓缩葡萄汁、葡萄糖(精馏浓缩葡萄汁)和葡萄酒发酵衍生的乙醇中的氘分布(OIV-MA-AS311-05) 葡萄汁中的糖分和水所包含的氘在葡萄酒分子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ发酵后重新分配。
本方法可用来测量葡萄酒乙醇中的氘同位素比(D/H)和葡萄(酿酒葡萄汁、浓缩酿酒葡萄汁、精馏浓缩葡萄汁)发酵而来的乙醇中的氘同位素比(D/H)。
(D/H) Ⅰ :与分子Ⅰ相关的同位素比。
(D/H) Ⅱ :与分子Ⅱ相关的同位素比。
R 表示分子Ⅰ和分子Ⅱ中氘的相对分布,可从信号强度 h (峰高)直接测量 R ,则
R =3 h Ⅱ / h Ⅰ
以上所定义的参数 R 、(D/H) Ⅰ 和(D/H) Ⅱ 可以用葡萄酒中萃取的乙醇中的核磁氘共振技术测定,也可以用给定条件下得到的酿酒葡萄汁、浓缩酿酒葡萄汁或葡萄汁(精馏浓缩酿酒葡萄汁)的发酵产品获得的乙醇中的核磁氘共振技术测定。
(6)通过气相色谱法测定来源于糖分的多元醇及干葡萄酒中残余糖分衍生的多元醇(OIV-MA-AS311-06) 同时测定葡萄酒中的赤藓糖醇、阿糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇和内消旋肌醇含量。虽然气相色谱法测定糖既费时又复杂,但该方法能够同时测定所有糖单体、二聚糖,甚至三聚糖,所以保留该法测定痕量糖分,特别是其他常规酶法不适用的痕量糖分(树胶醛糖、鼠李糖、甘露糖和阿糖醇)。
注:1.糖一旦被还原成醛醇形式,由于多元醇的出现,就无法进行测定。
2.以三甲基甲烷硅烷化衍生物(TMS)形式存在的糖,在葡萄酒中会出现不同的异构体,有 α 和 β 形式,甚至以3种或4种( γ ……)形式存在。
3.未经事先稀释,当含量超过5g/L时,用这种方法很难测定葡萄糖和果糖含量。
原理:干葡萄酒中的残余糖分可在生成三甲基甲烷硅烷化衍生物后用气相色谱法测定。内标物是季戊四醇。
(7)以微分pH法测定葡萄酒中的葡萄糖和果糖合计含量(OIV-MA-AS311-07) 本方法适用于分析葡萄酒中0~60g/L(平均水平)或者50~270g/L(高水平)的葡萄糖和果糖。
原理:以微分pH计测定葡萄糖和果糖合计含量,基于己糖激酶磷酸化葡萄糖和果糖,再定量检测H + ,H + 与葡萄糖和果糖含量具有化学计量学相关。
(8)以微分pH法测定葡萄酒中的葡萄糖、果糖和蔗糖总体含量(OIV-MA-AS311-08) 本方法适用于分析葡萄酒中0~270g/L的葡萄糖和果糖含量,这种定量法不同于以微分pH计定量葡萄糖和果糖,后者不能替代。
原理:以微分pH计测定葡萄糖、果糖和蔗糖的含量,蔗糖由转化酶初步水解,接着己糖激酶磷酸化葡萄糖和果糖,再定量检测H + ,H + 与葡萄糖和果糖含量具有化学计量学相关。
(1)酒精度(以容积计) 酒精度(以容积计)是100L葡萄酒中所含以升表示的乙醇含量,两个容积均在20℃时测定,以体积分数表示。
注:出现在馏出物中的乙醇同系物,以及乙醇与乙醇同系物的酯类也包括在酒精度中。
①OIV-MA-AS312-01A a.使用氢氧化钙的悬浮液把葡萄酒蒸馏物变成碱性,测定馏出物的酒精度;b.对于Ⅰ类方法,可选择比重瓶测定馏出物的酒精度,或带振荡器的电子密度计测定葡萄酒的酒精度,也可采用液体比重天平的密度计测定葡萄酒的酒精度。
②OIV-MA-AS312-01B a.使用氢氧化钙的悬浮液把葡萄酒蒸馏物变成碱性,测定馏出物的酒精度;b.对于Ⅳ类方法,可用密度计测定馏出物的酒精度或折射法测定葡萄酒的酒精度。
(2)甲醇
①OIV-MA-AS312-03A 气相色谱法测定葡萄酒馏出物中的甲醇,内标法定量。
②OIV-MA-AS312-03B 将葡萄酒蒸馏物稀释到乙醇含量为5%(体积分数),用(磷酸酸化的)高锰酸钾将甲醇氧化成甲醛。在硫酸中,甲醛与变色酸反应生成具有紫罗兰色的产物,分光光度法测定575nm处的吸光强度可定量得到甲醛含量,再计算出甲醇含量。
(3)丙三醇和2,3-丁二醇(OIV-MA-AS312-06) 通过阴离子交换树脂柱固定糖、大量甘露醇和山梨糖醇后,用高碘酸氧化丙三醇和2,3-丁二醇。比色法测定480nm处间苯三酚在甲醛(通过甘油氧化)作用下生成产物的吸光度,570nm处测定哌啶溶液和亚硝基铁氰化钠溶液与乙醇(通过氧化2,3-丁二醇)反应生成产物的吸光度。
(4)丙三醇(OIV-MA-AS312-05) 磷酸化的丙三醇在三磷酸腺苷(ATP)作用下被甘油激酶(GK)催化,生成磷酸甘油脱氢酶,之后在丙酮酸激酶(PK)存在的情况下,用磷酸烯醇丙酮酸(PEP)将二磷酸腺苷(ADP)转化成ATP,并生成丙酮酸,丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)存在的情况下被还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)转化成乳酸盐。反应过程中生成NDA + 的量与丙三醇的量成正比,可通过波长334nm、340nm或365nm时的吸光度减弱来测量NDA + 的量。
(5)乙醇的同位素比 13 C/ 12 C(OIV-MA-AS312-06) 本方法可以测量葡萄酒中乙醇的同位素比 13 C/ 12 C,以及葡萄(酿酒葡萄汁、浓缩酿酒葡萄汁、葡萄汁)衍生产品发酵后所得乙醇的同位素比 13 C/ 12 C。
参考标准:ISO 5725:1994《测量方法和测量结果的准确度(真实性和精度):测定标准测量方法的重复性和再现性的基本方法》;V-PDB [Vienna-Pee-Dee Belemnite 维也纳PeeDee箭石标准( R PDB =0.0112372, R PDB 为Pee Dee箭石标准物质中 13 C丰度)];OIV方法《应用核磁氘共振(RMN-FINS)检测酿酒葡萄汁、浓缩酿酒葡萄汁、葡萄汁和葡萄酒》。
方法原理:植物吸收二氧化碳进行新陈代谢,新陈代谢C 3 (卡尔文循环)和C 4 (Hatch和Slack)。这两种形式的光合作用呈现出不同类型的同位素分馏,来自C 4 植物或其发酵生成的糖和酒精,其 13 C含量高于C 3 植物来源的产品。葡萄和甜菜等绝大多数植物属于C 3 类别,甘蔗和玉米属于C 4 类别。测量 13 C含量可以检测和定量添加到葡萄(葡萄汁、葡萄酒)衍生产品中的C 4 植物(甘蔗或玉米代用糖)来源的糖。综合 13 C含量信息和RMN-FINS获得的信息,可以定量所添加的C 3 和C 4 植物来源的混合糖或酒精。完全燃烧样品,用产生的二氧化碳测定 13 C含量,用同位素质谱仪的三个不同捕集器测量离子电流,再用离子电流测定由同位素 18 O、 17 O、 16 O、 13 C和 12 C之间可能的不同组合所形成的主要质谱同位素44( 12 C 16 O 2 )、45( 13 C 16 O 2 和 12 C 17 O 16 O)和46( 12 C 16 O 18 O)的丰度。由于同位素 13 C 17 O 16 O和 12 C 17 O 2 的量极少,其贡献有时可以忽略不计。在考虑 18 O和 17 O的相对丰度的情况下,根据 m / z =46时测得的电流强度计算所得的 12 C 17 O 16 O的贡献,修正 m / z =45时的离子电流(克雷格修正),与校准标准物质和国际标准物质V-PDB相比较,计算出 δ 13 C相对标度下的 13 C含量。
(6)气相色谱或高效液相色谱结合同位素比质谱法(GC-C-IRMS或HPLC-IRMS)测定葡萄酒中丙三醇的 13 C/ 12 C(OIV-AS312-07) 基于气相色谱或液相色谱结合同位素比质谱法(GC-C-IRMS或HPLC-IRMS)测量丙三醇的 13 C/ 12 C比。如需同时定量 13 C/ 12 C同位素比,可以采用GC-IRMS。采用1,5-戊二醇作为内标物,还可以在分析 13 C/ 12 C比的同时,测定丙三醇浓度。
13 C/ 12 C:给定样品的 13 C与 12 C的同位素比; δ 13 C:以千分之几(‰,每毫升)表示的 13 C含量;
GC-C-IRMS:气相色谱-燃烧-稳定同位素比质谱法;
V-PDB:维也纳皮迪箭石。PDB是测量 13 C同位素含量自然变异的一级标准物质,由来源于美国南卡罗莱纳州白垩纪皮迪组的白垩纪箭石中心的碳酸钙构成,其 13 C/ 12 C同位素比或 R PDB 是0.0112372。PDB储量已经耗尽很长时间,但它一直是表示 13 C同位素含量自然变异的主要标准,在奥地利维也纳的IAEA(国际原子能组织)可以获得的参考物质以它为基准校准。按照惯例,自然出现的 13 C同位素按与V-PDB相关表示。
因光合作用C 3 循环(卡尔文循环)和C 4 循环(Hatch-Slack循环)不同,植物来源糖的 13 C含量大相径庭。葡萄和甜菜等绝大多数植物属于C 3 类别,而玉米和甘蔗属于C 4 类别。糖的 13 C含量与发酵得到的相应代谢产物(乙醇、丙三醇)中的 13 C含量相关联。
测量丙三醇的 13 C含量可能检测到葡萄酒或酒精饮料中添加的玉米(C 4 植物)来源或人为合成(化石来源)的丙三醇。采用气相色谱法或液相色谱法从葡萄酒基体中分离丙三醇。在GC-IRMS中,经色谱分离后,流出物通过燃烧界面的氧化还原炉,经历一个燃烧步骤和一个还原步骤。除丙三醇以外的组分,在流动过程中随反冲阀排出,以免弄脏炉子,干扰色谱图。样品中的丙三醇一旦被氧化,就会产生CO 2 和H 2 O,用全氟磺酸(Nafion)膜制成的水分去除阱去除燃烧过程中产生的水,用产生的二氧化碳测定 13 C含量,用氦流将二氧化碳带入到IRMS源进行 13 C/ 12 C分析。在HPLC-IRMS中,色谱分离后,样品还在界面处于流动相时即被氧化,生成的CO 2 从溶剂流中在线去除,通过气体交换膜进入氦气流,该氦气流经过全氟磺酸膜制成的水分去除阱,然后通过分流口进入IRMS的离子源。 18 O、 17 O、 16 O和 13 C、 12 C同位素的各种不同组合导致质量数为44的离子束对应于 12 C 16 O 2 同位素,质量数为45的离子束对应于 13 C 16 O 2 和 12 C 17 O 16 O,质量数为46的离子束对应 12 C 16 O 18 O的同位素( 13 C 17 O 16 O和 12 C 17 O 2 因为丰度极低可以忽略不计),相应的离子电流在三个不同的捕集器上测定,通过考虑 18 O和 17 O的相对丰度,根据 m / z =46测得的电流强度计算所得的 12 C 17 O 16 O的贡献,修正 m / z =45的离子电流(克雷格修正),与按国际标准V-PDB校准的标准物质相比较,计算出 δ 13 C‰相对标度下的 13 C含量。
(1)总酸度(OIV-MA-AS313-01) 葡萄酒的总酸度是参照碱性标准溶液将其滴定到pH7时的可滴定酸度总和,总酸度不包括二氧化碳。
电位滴定或以溴麝香草酚蓝作为指示剂滴定,并与终点标准颜色比较。
(2)挥发酸(OIV-MA-AS313-02) 挥发酸来源于葡萄酒中以游离态及盐形式出现的乙酸。
首先从葡萄酒中去除二氧化碳,通过蒸馏分离葡萄酒中的挥发酸,用氢氧化钠标准溶液滴定。按以上蒸馏条件产生的游离和结合二氧化硫的酸度,应从馏出物的酸度中扣除,任何可能添加到葡萄酒中的硼酸的酸度,也必须扣除。
注:某些国家用以在分析前稳定葡萄酒的部分水杨酸会出现在馏出物中,必须加以测定,并从酸度中扣除。
(3)非挥发性酸度(OIV-MA-AS313-03) 按总酸度与挥发性酸度之差计算非挥发性酸度。
(4)有机酸(OIV-MA-AS313-04) 高效液相色谱法同时分离测定葡萄酒中的有机酸。
有机酸可用辛基键合硅胶柱和离子交换树脂柱这两种固定相分离,用紫外分光光度法测定。测定苹果酸和酒石酸时,建议使用辛基键合硅柱,对于柠檬酸和乳酸,建议使用离子交换树脂柱,外标法定量。本方法还可以测评莽草酸、醋酸、琥珀酸和富马酸的含量。
注:其他类型的色谱柱也可以很好地进行分离。
(5)酒石酸(OIV-MA-AS313-05A) 酒石酸以(±)酒石酸钙的形式沉淀,用重量分析法测定,也可以用容量法测定,以便进行比较。沉淀条件(pH值、总使用体积、沉淀离子浓度)为(±)酒石酸钙沉淀完成后,D(-)-酒石酸钙仍然留在溶液中。当葡萄酒中添加了偏酒石酸时,会导致(±)酒石酸钙沉淀不完全,必须首先水解。
(6)乳酸(OIV-MA-AS313-07) 总乳酸(L-乳酸和D-乳酸)经L-乳酸脱氢酶(L-LDH)和D-乳酸脱氢酶(D-LDH)催化,被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)氧化成丙酮酸。正常情况下,反应平衡有利于生成更多乳酸盐,从反应混合物中去除丙酮酸,取代了趋向生成丙酮酸的平衡,在存在L-谷氨酸的情况下,丙酮酸在转氨酶(GPT)催化的反应中转化成丙氨酸。所生成的NADH量,可以用波长340nm时的吸光度增加来测量,所生成的NADH量与原本就存在的乳酸盐的量成正比。
(7)柠檬酸
a.化学法(OIV-MA-AS313-08) 柠檬酸和葡萄酒中的其他酸固定到阴离子交换柱上,通过分馏洗脱物获取柠檬酸。柠檬酸被氧化成丙酮,以蒸馏法分离,乙醛(乙醇)氧化成醋酸,用碘量滴定法测定丙酮。
b.酶法(OIV-MA-AS313-09) 柠檬酸在柠檬酸裂解酶(CL)催化下转化成草酰乙酸和醋酸盐。当存在苹果酸酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)时,草酰乙酸及其脱羧衍生物、丙酮酸被还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)还原成L-苹果酸和L-乳酸。这些反应中由NADH氧化成NAD + 的量与存在的柠檬酸盐的量成正比,以波长340nm时的吸光度下的生成物减少量来测量NAD + 的量。
(8)总苹果酸(OIV-MA-AS313-10) 苹果酸经阴离子交换柱分离,在浓硫酸作用下,与变色酸生成黄光,在洗脱液中以比色法测定,从使用96%强度酸获得的吸光度中减去分别用86%硫酸和变色酸获得的吸光度,可以修正干扰物质。
(9)左旋苹果酸(OIV-MA-AS313-11) 左旋苹果酸(L-苹果酸)在L-苹果酸脱氢酶(L-MDH)催化下,被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)氧化成草酰乙酸。正常情况下,苹果酸盐更容易达到反应平衡,从反应混合物中去除草酰乙酸,取代了趋向生成草酰乙酸的平衡。在L-谷氨酸作用下,草酰乙酸经谷草转氨酶(GOT)催化转化成门冬氨酸,所生成的NADH量与原本就存在的苹果酸的量成正比,可以用波长340nm时的吸光度增加来测量。
(10)D-苹果酸
a.OIV-MA-AS313-12A 在苹果酸脱氢酶(D-MDH)作用下,D-苹果酸(苹果酸)被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)氧化成草酰乙酸,所生成的草酰乙酸转化成丙酮酸和二氧化碳,通过334nm、340nm或365nm波长时吸光度的增加测量生成的NADH,所生成的NADH量与所存在的苹果酸的量成正比。
b.OIV-MA-AS313-12B 方法适用于以酶法测定葡萄酒中含量低于50mg/L的苹果酸。
原理:苹果酸[D(+)-苹果酸]被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)氧化成草酰乙酸,草酰乙酸转化成丙酮酸和二氧化碳。所生成的NADH可以用波长340nm时的吸光度增加来测量,所生成的NADH量与试管中加入50mg/L苹果酸后存在的苹果酸的量成正比(测定浓度为50mg/L以上苹果酸D方法的原理)。
(11)L-抗坏血酸(OIV-MA-AS313-13A) 抗坏血酸在活性炭的作用下转化成脱氢抗坏血酸,与邻苯二胺(OPDA)反应生成荧光化合物,在存在硼酸的情况下制备对照物,对照物可(通过生成硼酸/脱氢抗坏血酸络合物)测定杂散荧光。用荧光测定法分析样品和对照物,计算脱氢抗坏血酸的浓度。
(12)山梨酸
a.比色法(OIV-MA-AS313-14A) 葡萄酒中山梨酸(反,反,2,4-己二烯酸)通过蒸馏法提取,紫外吸收分光光度法测定。用氢氧化钙调节溶液至弱碱性,蒸干去除干扰紫外线吸收测量的物质。少于20mg/L的样品可以用薄层色谱法(灵敏度:1mg/L)确认。
b.气相色谱法(OIV-MA-AS313-14B) 山梨酸经乙醚提取,气相色谱测定,内标法定量。
c.薄层色谱法(OIV-MA-AS313-14C) 薄层色谱法分离经乙醚萃取的山梨酸,半定量法评估其浓度。
d.毛细管电泳法(OIV-MA-AS313-18) 用于测定葡萄酒中0~300mg/L范围的山梨酸。
原理:毛细管电泳分离带负电荷的山梨酸盐离子,在毛细管出口254nm紫外吸收检测。
(13)pH值(OIV-MA-AS313-15)
测量浸于液体中的两个电极之间的电位差,这两个电极其中之一的电位是液体pH值的函数,另一个电极的电位已知固定,作为参比电极。
(14)有机酸和无机阴离子(OIV-MA-AS313-16) 本方法的主要作用是,离子交换柱可用以分离绝大部分有机酸和无机阴离子,由于酚类化合物的存在,以电导分析法进行检测可以使分析免受干扰。这种类型的干扰在色谱法中非常明显,色谱法包括在210nm时经紫外线照射进行检测。
这种离子色谱法测定无机阴离子和有机酸的方法适用于酒精饮料(葡萄酒、葡萄蒸馏酒和利口酒),可用以测量表2-1所列浓度范围的有机酸,这些浓度通过稀释样品获得。
表2-1 离子色谱法进行分析的阴离子的浓度范围
上述浓度范围用作实验范例,包括通常使用的校准方法,根据所用装置(色谱柱的性质、检测器的灵敏度等)和程序(注射样品的体积、稀释等)的类型而适用。
分离离子交换柱上的无机阴离子和有机阴离子,过电导分析法检测,采用保留时间定性,用校准曲线定量。
(15)莽草酸(OIV-MA-AS313-17) 莽草酸(3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸)是用生物合成方式由奎宁酸脱水合成,扮演着苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和植物类碱的前驱体的角色。作为一种次要羧酸,莽草酸天然存在于许多水果中。鼓励成员国继续在该领域进行研究,以避免对结果的任何非科学评估。本方法在一次协作研究后生效,该协作研究旨在分析葡萄酒样品中天然存在的10~150mg/L范围的莽草酸,其真实性经实验室间分别采用HPLC、GC/FID和GC-MS进行比较证实。
高效液相色谱法定量测定红葡萄酒、玫瑰葡萄酒和白葡萄酒(包括含气葡萄酒和特种葡萄酒)中浓度范围在1~300mg/L之间的莽草酸。本方法应用于含气葡萄酒时,样品必须经事先脱气处理(例如超声)。
采用耦合色谱柱系统的高效液相色谱法,无需事先制备样品,即可直接测定莽草酸。C 18 反相色谱柱预先分离葡萄酒中的有机酸,再在65℃时用阳离子交换柱进行最终分离,用弱酸水作淋洗液,无葡萄酒基质干扰下可以使莽草酸与基线分离。由于环己烯环形物系统内的双键,莽草酸的吸收性强,在210nm处有明显紫外吸收。
(16)主要有机酸和硫酸盐(OIV-MA-AS313-19) 在简单稀释、添加内标物后,以毛细管电泳分离和检测酒石酸、苹果酸和乳酸及硫酸盐。
毛细管电泳可用于测定酿酒葡萄汁中的酒石酸和苹果酸,以及经事先稀释、脱气和过滤(如需要)的葡萄酒中的酒石酸、苹果酸和乳酸。
毛细管电泳是在存在高压电流的情况下,用带合适缓冲溶液和极细内壁的毛细管,有效分离大小带电分子的所有技术。电泳缓冲液:含有一种或多种溶剂和水溶液,具有合适电泳淌度,用以缓冲pH值的溶液。电泳淌度:离子在电场作用下快速移动的倾向。电渗流:在电场和硅电荷的作用下,溶剂在缓冲溶液中因溶剂离子取代而沿毛细管内壁流动。
在参考缓冲剂的缓冲电解液中,通过毛细管电泳,混合水溶液产生差异化迁移而被分离。电泳发生在内径为25~75 μ m之间的石英管中,拟分离的水溶液由两股力同时驱动,这两股力由电场和电渗流引起,既可按相同方向运动,也可按相反方向运动。电场存在于置于1cm电泳管里的电极之间,体现为电压,以V/cm表示。移动性是离子的特征,分子越小,其电泳淌度越大。如果毛细管内壁未涂层,硅的负电荷会固定缓冲液的部分阳离子,阳离子溶解和被取代,并向缓冲液中阴极移动,形成电渗流。缓冲液和添加剂的pH值可以选择,以控制电渗流的方向和强度。在缓冲液中添加具有光谱吸收的离子可以获得负峰,负峰可以定量表示拟分离液体,拟分离溶液在所用波长不吸光。
(17)山梨醇、苯甲酸和水杨酸(OIV-MA-AS313-20) 山梨酸及其钾盐是葡萄酒酿造中可以使用的一种防腐剂,但由于山梨酸被乳酸菌分解时散发出一种天竺葵的气味,某些国家甚至不允许痕量的出现。苯甲酸和水杨酸仍然禁止用于葡萄酒,但可用于其他饮料。
该方法适用于所有葡萄酒和葡萄汁,特别是那些可能含有痕量山梨酸、苯甲酸和水杨酸(1mg/L示踪)的葡萄酒和葡萄汁。
将样品直接注射进样,通过等梯度反相分配色谱分离,在235nm波长进行紫外检测。
(18)偏酒石酸(OIV-MA-AS313-21) 添加到葡萄酒中以避免酒石沉淀的偏酒石酸,传统上按偏酒石酸热水解后的总酒石酸和水解前的天然酒石酸之差成正比例添加。但是,考虑到测定酒石酸的精度,不可以用这种方法检测痕量偏酒石酸,因此,对于在某些国家不被认可的添加剂,必须用更有针对性的方法描述其特征。
该方法适用于可能含有痕量偏酒石酸的葡萄酒。
在相对酸性介质中,偏酒石酸与乙酸镉生成不溶性沉淀物,这只是酿酒葡萄汁和葡萄酒中形成沉淀物的全部元素中的一种。
注:酒石酸与乙酸镉也可以形成沉淀,但是仅当酒精度高于25%(体积分数)时才会发生。与用偏酒石酸获得沉淀物不同的是,这种沉淀物可以再溶于水,通过用氢氧化钠加热分解偏酒石酸的镉沉淀物,释放出酒石酸,后者和偏钒酸铵一起形成一种特别的橙色。
(19)抗坏血酸和D-异抗坏血酸(OIV-MA-AS313-22) 抗坏血酸是许多食物中天然存在的抗氧化剂。葡萄中天然存在的抗坏血酸的量在酿酒葡萄汁和葡萄酒的生产过程中不断减少,但可在一定限量内添加到酿酒葡萄汁和葡萄酒中。所述方法经协作研究确认,该协作研究分析了分别添加30~150mg/L和10~100mg/L的抗坏血酸和D-异抗坏血酸的葡萄酒样品。
本方法适用于以高效液相色谱法同时测定葡萄酒中3~150mg/L范围之间的抗坏血酸和D-异抗坏血酸。对于浓度高于150mg/L的,样品需要稀释。
样品经膜过滤后直接注射入HPLC系统,在反相色谱柱上分离分析物,266nm时进行紫外检测,外标法定量抗坏血酸和D-异抗坏血酸。
(20)鉴定植物或化石来源的L-酒石酸(OIV-MA-AS313-23) 本方法可以鉴定植物来源或化石来源的酒石酸,在两者混合的情况下,测定两种类型的相应比例,本方法可以检测含量低于10%的化石衍生的L(+)-酒石酸。
在多数情况下,商用的植物源酒石酸是一种葡萄酒酿造产品。酿造残渣中的酒石酸氢钾经萃取,以L-酒石酸形式出售,因此酸中的 14 C浓度,与葡萄酒中的乙醇相关,与相同年份出产地葡萄酒中二氧化碳的 14 C浓度相关,该浓度由于涉及人类活动而相对较高。另一方面,化石燃料副产品衍生的合成酒石酸中的 14 C浓度很低,甚至可以忽略不计。使用液体闪烁法测量碳的 14 C活性,以DPM(每分钟衰变)/克表示,可以测定碳的来源以及任何组合类型。
(1)二氧化碳(OIV-MA-AS314-01)
①平静葡萄酒(CO 2 压力≤0.5×10 5 Pa):从样品中取出一定体积葡萄酒,冷却到大约0℃,与足量氢氧化钠混合,使pH值达到10~11,在存在碳酸酐的情况下,以酸溶液滴定,按pH值从8.6(碳酸氢盐形式)变成4.0(碳酸)所需酸溶液体积计算出二氧化碳含量。在相同条件下对脱气葡萄酒进行空白滴定,以便考虑葡萄酒中酸中和的氢氧化钠溶液的体积。
②起泡葡萄酒和半起泡葡萄酒:将拟分析葡萄酒样品冷却至接近凝点,脱碳后移出一部分样本作空白,将酒瓶中的剩余物变成碱性,以Na 2 CO 3 形式固定全部二氧化碳,在存在碳酸酐的情况下,用酸溶液滴定,按pH值从8.6(碳酸氢盐形式)变成4.0(碳酸)所需酸溶液体积计算出二氧化碳含量。在相同条件下对脱气葡萄酒进行空白滴定,以便考虑葡萄酒中酸中和的氢氧化钠溶液的体积。
(2)过压(OIV-MA-AS314-02) 经热稳定和摇动酒瓶后,压力计测量过压,以帕斯卡(Pa)表示。
(3)起泡葡萄酒中CO 2 的碳同位素比 13 C/ 12 C(OIV-MA-AS314-03) 起泡葡萄酒的顶空部分包含了富含CO 2 的气相,该气相与溶于液相的CO 2 相平衡,该气体在添加葡萄、甜菜、甘蔗或玉米来源的糖所诱发的二次发酵过程中逸出,然而起泡葡萄酒的CO 2 含量也可能因工业CO 2 而人为增加。1997年,一种以同位素质谱分析法(IRMS)离线测定起泡葡萄酒中CO 2 的 13 C/ 12 C同位素比的方法提交给了国际葡萄与葡萄酒组织,这种方法形成了一种基于某些欧洲实验室所开发的自动化在线技术的新程序,这些程序其中之一已于2001年提交给国际葡萄与葡萄酒组织,接下来的几年中,技术进步可能很容易形成快捷、可靠地测定很多CO 2 样品的 13 C/ 12 C同位素比的新程序。若详尽描述不同技术都适用的程序,可能存在使该方法被快速取代的风险。该方法考虑了这一点,描述了从起泡葡萄酒中准确测量CO 2 中的 13 C含量的基本原理,包括对目前所用程序的简要描述,以及通过举例方式对某些基于离线和在线技术的程序进行了详尽描述。
本方法以同位素比质谱分析法(IRMS)测定起泡葡萄酒中的稳定碳同位素比( 13 C/ 12 C)。该方法包括一系列程序,这些程序的使用取决于仪器的适用性。
植物依糖合成路径分为C 3 植物和C 4 植物。来源于C 3 植物的葡萄、甜菜植物的糖 13 C含量比来源于C 4 植物糖分低,如甘蔗和玉米等,这种差别还保留在乙醇和CO 2 等糖的发酵产品的 13 C含量中,而且食品工业所用工业CO 2 和化石燃料燃烧产生的CO 2 或热处理碳酸盐产生的CO 2 ,其 13 C含量与C 3 和C 4 植物产品不同。以致起泡葡萄酒来源CO 2 的 13 C/ 12 C同位素比取决于二次发酵所用糖的类型(C 3 或C 4 )或所添加的工业CO 2 的同位素组成。
到目前为止,对起泡葡萄酒来源CO 2 的 13 C含量进行的研究表明,由C 3 植物来源糖发酵获得的CO 2 ,其 13 C范围为-17‰~-26‰,而由C 4 植物来源糖发酵获得的CO 2 ,其 13 C含量范围在-7‰~-10‰之间。起泡葡萄酒的 13 C/ 12 C同位素比,视二氧化碳来源不同而低于-29‰或高于-10‰。因此,测量起泡葡萄酒来源CO 2 的稳定同位素比( 13 C/ 12 C)是一种发现气体来源的好办法。
测定起泡葡萄酒中二氧化碳 13 C的含量。同位素 18 O、 17 O、 16 O和 13 C、 12 C的多种不同组合,导致质量数44对应于 12 C 16 O 2 ,质量数45对应于 13 C 16 O 2 和 12 C 17 O 16 O种类,质量数46对应于 12 C 16 O 18 O( 13 C 17 O 16 O和 12 C 17 O 2 因其丰度极低可忽略不计)。从三个不同的收集器上测定相应的离子电流,在考虑 18 O和 17 O的相对丰度的情况下,根据 m / z 为46时测得的电流强度计算所得的 12 C 17 O 16 O的贡献,修正 m / z 为45时的离子电流(克雷格修正),与按国际标准V-PDB校准的参考物质相比较,可以计算出 13 C‰相对标度上的 13 C含量。
(4)二氧化碳-测压法(OIV-MA-AS314-04) 样品中的二氧化碳与10mol/L氢氧化钠结合,将带侧臂的爱伦美氏烧瓶连接至压力计,二氧化碳随硫酸从已制备样品中释放出来,测量生成物的压力增加值,定量二氧化碳含量。
(1)乙醛(OIV-MA-AS315-01) 葡萄酒经过活性炭脱色,酒中乙醛与亚硝基铁氰化钠和哌啶反应,颜色由绿色变为紫罗兰色,570nm检测吸光度。
(2)乙酸乙酯
a.OIV-MA-AS315-02A 采用气相色谱对葡萄酒蒸馏物中乙酸乙酯进行分析,内标法定量。
b.OIV-MA-AS315-02B 调节葡萄酒pH为6.5,蒸馏,馏出物在碱性条件下皂化和浓缩后进一步被酸化,冷凝后得到的乙酸用碱性溶液滴定,间接得到乙酸乙酯的含量。
(3)锦葵花素双葡萄糖苷(OIV-MA-AS315-03) 被硝酸氧化的锦葵花素双葡萄糖苷,转化为可在氨基介质中经紫外线照射发出翡翠绿荧光的物质。以锦葵花素双葡萄糖苷参考标准溶液校准定量的硫酸奎宁标准溶液,通过与硫酸奎宁溶液荧光强度的比较,定量被测葡萄酒中锦葵花素双葡萄糖苷含量。需要注意的是,由于游离二氧化硫的存在能够降低荧光强度,因此需要事先加入过量乙醛,使其与二氧化硫结合消除其影响。
(4)氨基甲酸乙酯(OIV-MA-AS315-04) 氨基甲酸丙酯作为内标物加入样品中,溶液经水稀释,置入50mL固相萃取柱。氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯被二氯甲烷洗脱,洗脱液通过真空旋转蒸发浓缩,浓缩液通过选择离子监测模式下气相色谱质谱分析。氨基甲酸乙酯测定范围为10~20 μ g/L。
(5)羟甲基糠醛(HMF)
a.OIV-MA-AS315-05A 来源于呋喃的醛类,主要是羟甲基糖醛,与巴比妥酸和对甲苯胺反应,生成一种红色化合物,可采用比色法在550nm测定。游离的硫酸会干扰测定,当其含量超过10mg/L时,须事先用乙醛与之结合来去除,过量乙醛不会干扰测定。
b.OIV-MA-AS315-05B 液相色谱法,通过反相色谱分离,280nm测定。
(6)氰基衍生物(OIV-MA-AS315-06) 酸水解释放出游离氢氰酸和总氢氰酸,蒸馏法分离。氢氰酸与氯化胺-T和吡啶反应,反应产物戊烯二醛与1,3-二甲基巴比妥酸一起发出蓝色,比色法测定。
(7)人工合成甜味剂
a.OIV-MA-AS315-07A 检测糖精(邻磺酰苯酰亚胺钠)、甘素(对乙氧基苯脲)、甜蜜素(环己基氨基磺酸盐)和P-4000(5-硝基-2-丙氧基苯胺或1-丙氧基-2-氨基-4-硝基苯)。浓缩后,葡萄酒中糖精、甘素和P-4000在酸性介质中被苯提取,留在葡萄酒中的甜蜜素通过乙酸乙酯提取(提取顺序非常重要)。提取溶液蒸发后的残余物通过薄层色谱分析,在纤维素板上测定糖精和甜蜜素(溶剂:丙酮-乙酸乙酯-氨水)。首先分析苯提取溶液,然后用乙醚洗涤,再分析乙酸乙酯提取溶液。这些甜味剂经联苯胺、苯胺、醋酸铜溶液喷洒后显谱,比移值 R f 分别为甜蜜素:0.29,糖精:0.46。P-4000和甘素经苯提取后,在聚酰胺板上薄层色谱分离,(溶剂:甲苯、甲醇、冰醋酸)。这两种甜味剂经对二甲基苯甲醛溶液喷洒后显谱,比移值 R f 分别为甘素:0.60,P-4000:0.46。
b.OIV-MA-AS315-07B 检测糖精、甘素和甜蜜素(环己基氨基磺酸盐)。
首先用液体离子交换剂从葡萄酒中提取甜味剂,然后用稀氨水提取,薄层色谱分离,色谱板使用纤维素粉和聚酰胺粉混剂(溶剂:二甲苯、正丙醇、冰醋酸、甲酸)。这些甜味剂经2,7-二氯荧光素溶液喷洒后,经紫外线照射,在黄色背景下显蓝色荧光。随后用二甲氨基苯甲醛溶液喷洒,甘素显示橙色斑点,从而可以区分与甘素具有相同比移值 R f 的香草醛及对羟基苯甲酸酯类。
(8)合成着色剂(OIV-MA-AS315-08) 将葡萄酒浓缩到原取样体积的1/3,用稀氢氧化钠溶液调节至碱性,乙醚提取,乙醚相经水洗后用稀乙酸溶液提取。准备一片经硫酸铝和酒石酸钾处理过的羊毛织物,在存在羊毛织物的情况下,加入氨水,加热至沸腾,着色剂(若有)会附着在羊毛织物上,随后将附有着色剂的羊毛织物置于稀乙酸溶液中,蒸发乙酸溶液后,用乙醇水溶液溶解残留物,最后用薄层色谱分析。
乙醚萃取后的水相中可能存在酸性着色剂,利用对动物纤维的显著吸附能力,酸性着色剂可在酸性介质中被固定在羊毛纤维上,采用逐渐减少羊毛织物的体积,通过二次固定吸附或多次固定吸附,最大程度吸附酸性着色剂。羊毛织物着色表明葡萄酒中添加了合成着色剂,可用薄层色谱分析鉴定着色剂。
(9)二甘醇(2-羟基-乙氧基乙醇)(OIV-MA-AS315-09) 检测葡萄酒中浓度大于或等于10mg/L的二甘醇,HOCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OH。乙醚提取后,用毛细管气相色谱法将二甘醇与葡萄酒中的其他成分分离检测。
(10)赭曲霉毒素A(OIV-MA-AS315-10) 本方法描述了用免疫亲和柱和高效液相色谱法测定红葡萄酒、玫瑰红葡萄酒、白葡萄酒及特殊葡萄酒中浓度在10 μ g/L以下的赭曲霉毒素A(OTA)的检测方法。依据国际联合研究,本方法对0.01~3.00 μ g/L天然本底浓度范围赭曲霉毒素A(OTA)的检测有效。本方法可用于低泡葡萄酒、起泡葡萄酒和预先通过超声等手段脱气的葡萄酒中赭曲霉毒素A的检测。
用含有聚乙二醇和碳酸氢钠的溶液稀释葡萄酒样品,样品溶液在免疫亲和柱上过滤和纯化,以甲醇洗脱OTA,反相HPLC荧光定量检测。
(11)9种主要花青素(OIV-MA-AS315-11) 本方法涉及测定红葡萄酒和玫瑰葡萄酒中花青素的相对组成,反相HPLC-UV-VIS检测。
分离红葡萄酒和玫瑰葡萄酒中5种最重要的非酰基化花青素和4种主要的酰基花青素。以水/甲酸/乙腈进行梯度洗脱,用反相HPLC直接分离,在518nm检测。
(12)植物蛋白质(OIV-MA-AS315-12) 以三氯乙酸沉淀葡萄酒和酿酒葡萄汁中蛋白,然后沉淀蛋白在十二烷基硫酸钠(DSS)聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。添加考马斯蓝将蛋白质染色,事先用已知蛋白质浓度的溶液绘制校准曲线,颜色强度反映蛋白质含量。酿酒葡萄汁和经处理葡萄酒的抗原性能可通过免疫印迹法测定。
(13)溶解酵素(OIV-MA-AS315-14) 本方法可定量分析红、白葡萄酒中溶解酵素,不受酶活性的影响(酶活性可受到部分变性、生成络合物或共沉淀现象抑制)。高效液相色谱法提供了一种基于固定相与分析物之间的空间相互作用、极性相互作用或吸附相互作用的分析方法,因而与蛋白质所呈现的实际酶活性无关。HPLC荧光检测器进行分析,通过计算峰面积进行外标法定量。
(14)3-甲氧基-1,2-丙二醇(3-MPD)和环状双甘油(CycDs)(OIV-MA-AS315-15) 本方法测定不同类型葡萄酒中3-甲氧基-1,2-丙二醇(3-MPD)和环状双甘油(CycDs)(两者均被视为工业甘油的杂质),方法经国际间验证。众所周知,动植物中的甘油三酸酯在甲醇作用下转化为甘油,甘油中会带有相当量的杂质3-甲氧基-1,2-丙二醇。石油化工产品合成的甘油会带有杂质环双甘油。所述方法适用于测定白葡萄酒、红葡萄酒、甜葡萄酒和干葡萄酒中的3-甲氧基-1,2-丙二醇(3-MPD)和6种环双甘油[顺式,反式-2,6-二(羟甲基)-1,4-二氧六环;顺式,反式-2,5-二(羟甲基)1,4-二氧六环;顺式,反式-2-羟甲基-6-羟基-1,4-二氧杂环庚烷]。3-甲氧基-1,2-丙二醇检测浓度范围为0.1~0.8mg/L,环双甘油为0.5~1.5m/L。
(15)2,4,6-三氯苯甲醚(OIV-MA-AS315-16) 测定软木塞释放的2,4,6-三氯苯甲醚(TCA)的方法可以测量浸渍在乙醇水溶液中的样品软木塞释放的TCA量。本方法的目的是评估被分析软木塞的释放风险,并提供一种控制软木塞质量的方法。本方法旨在模拟易在软木塞和葡萄酒之间产生的2,4,6-三氯苯甲醚迁移现象。软木塞浸在葡萄酒或乙醇水溶液中,直到平衡,以固相微萃取(SPME)技术从合适浸渍部位取顶空TCA样,气相色谱法分离,质谱仪(或电子俘获检测器)检测。
(16)聚氯酚和聚氯代茴香醚(OIV-MA-AS315-17) 方法适合测定所有葡萄酒、软木塞、皂土和木制品中聚氯酚和聚氯代茴香醚。通过正己烷提取葡萄酒,乙醚/正己烷提取固体样品,提取液注入气相色谱分析测定2,4,6-三氯苯甲醚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯甲醚、2,3,4,6-四氯苯酚、五氯苯甲醚和五氯苯酚,内标法定量,内标物为4-二溴苯酚或2,5-二溴苯酚。
(17)生物胺(OIV-MA-AS315-18) 本方法可用于分析酿酒葡萄汁和葡萄酒中的生物胺。乙醇胺(检测上限20mg/L);组胺(检测上限15mg/L);甲胺(检测上限10mg/L);5-羟色胺(检测上限20mg/L);乙胺(检测上限20mg/L);酪胺(检测上限20mg/L);异丙胺(检测上限20mg/L);丙胺(通常不得检出);异丁胺(检测上限15mg/L);丁胺(检测上限10mg/L);色胺(检测上限20mg/L);苯基乙胺(检测上限20mg/L);腐胺或1,4-二氨基丁烷(检测上限40mg/L);2-甲基丁胺(检测上限20mg/L);3-甲基丁胺(检测上限20mg/L);尸胺或1,5-二氨基戊烷(检测上限20mg/L);己胺(检测上限10mg/L)。
将生物胺邻苯二醛(OPA)衍生化后用C 18 柱分离,高效液相色谱荧光检测。
(18)谷胱甘肽(OIV-MA-AS315-19) 采用毛细管电泳(CE)荧光方法,可以测定酿酒葡萄汁和葡萄酒中浓度范围为0~40mg/L的谷胱甘肽含量。在电解质中,不同的物质在电场作用下有不同的迁移速率。在毛细管电泳中毛细管充满了电解质,将样品注射入毛细管的一端,由于浸在电解液中的电极产生的电场作用,溶质因为迁移速率差异而分离,并以信号峰的形式在毛细管的另一端得到检测。在给定操作条件下,迁移时间是确定分析物质的标准,且峰面积与分析物质注射量成正比。
(19) α -二羰基化合物 葡萄酒中已经发现的主要 α -二羰基化合物有:乙二醛、丙酮醛、二乙酰和戊烷-2,3-二酮,但葡萄酒中只有 α -二酮含量相对丰富。羰基化合物存在于所有类型的葡萄酒中,特别是经乳酸发酵的葡萄酒和红葡萄酒中。另外,以感染贵腐酶菌( Botrytis Cinerea )的白葡萄生产的甜白葡萄酒可含有较高水平的乙二醛和丙酮醛。二羰基化合物在葡萄酒中扮演着重要角色:感官影响、与葡萄酒中其他成分的反应或可能的微生物效应。
a.OIV-MA-AS315-20 本方法适用于二羰基化合物含量在0.05~20mg/L之间的所有类型的葡萄酒(白葡萄酒、红葡萄酒、甜葡萄酒或强化葡萄酒)。将葡萄酒的 α -二羰基化合物用1,2-二氨基苯衍生为喹喔啉类物质。pH值为8时,该反应在葡萄酒中直接发生,60℃反应3h后,高效液相色谱法直接分析衍生物,313nm紫外检测。
b.OIV-MA-AS315-21 本方法适用于二羰基化合物含量在0.05~20mg/L之间的所有类型的葡萄酒(白葡萄酒、红葡萄酒、甜葡萄酒或强化葡萄酒)。将葡萄酒的 α -二羰基化合物与1,2-二氨基苯在pH为8、60℃条件下反应3h后,生成喹喔啉类衍生物。以二氯甲烷萃取衍生物,气相色谱质谱(GC-MS)分析或气相色谱氮检测器分析。
(20)羧甲基纤维素(OIV-MA-AS315-22) 羧甲基纤维素(CMC)是一种来源于天然纤维素的聚合物,长期在食品加工中作食品添加剂使用,如用于冰淇淋和预先熟制食品,在白葡萄酒和起泡酒中使用羧甲基纤维素(CMC)有助于酒石酸稳定,OIV在决议2/2008中予以允许添加,但添加剂量须少于100mg/L。
本方法适用于白葡萄酒(平静葡萄酒和起泡葡萄酒)。
羧甲基纤维素(CMC)经透析从葡萄酒中分离,在酸性介质中水解生成乙醇酸,再降解生成甲醛,加入2,7-二羟基萘(DHN),生成2,2,7,7-四羟基二萘甲烷,生成的络合物在100℃且在浓硫酸的作用下显蓝紫色,540nm比色检测。
(21)过敏原残留(OIV-MA-AS315-23) 分析方法必须考虑到特定的酿酒工艺。
含过敏原蛋白质的添加剂或加工助剂:每种产品必须严格标识化学名称,产品须严格执行质量控制。
一般而言,酶联免疫法被认为是最合适和最简便的常规过敏原控制方法。检测葡萄酒中用作澄清剂的蛋白质潜在过敏原残留可采用夹心抗体、竞争免疫、直接或间接酶联免疫吸附等方法。若无酶标记抗体可用生物素标记抗体或生物素辣根过氧化物酶结合物。
(22)溶菌酶(OIV-MA-AS315-24) 本方法用以检测葡萄酒中添加的溶菌酶,但不用于测定作为过敏原化合物的溶菌酶。
本方法用于测定白葡萄酒中溶菌酶浓度范围在9~100mg/L之间,超过该范围的通过稀释至该范围检测。根据需要葡萄酒过滤和稀释后,直接注射入毛细管电泳仪,外标法定量检测。
(1)总溴(OIV-MA-AS321-01) 加入过量碱石灰,将葡萄酒在525℃时灰化,氯胺-T处理残留物溶液(调节pH至4.65)以释放溴化物,溴化物与酚红反应,生成四溴酚酞二磺酸,590nm时分光光度计测定生成物。
(2)氯化物(OIV-MA-SA321-02) 采用Ag/AgCl电极,用电位计在葡萄酒中直接测定氯化物。
(3)氟化物(OIV-MA-AS321-03) 本方法适用于分析所有类型葡萄酒中的氟化物。通过适当稀释,检测范围为0.1~10.0mg/L。
添加缓冲剂后,用氟离子选择电极测量样品中的氟化物浓度。缓冲剂可提供较高且稳定的背景离子强度,络合铁和铝(不然会与氟化物络合),并将pH值调节至使HF·HF络合物的生成最小化的水平,然后用标准加入法使基体效应最小化。
(4)总磷(OIV-MA-AS321-04) 将样品硝化氧解和灰化后,溶于盐酸中,通过测定黄色磷钒钼酸铵络合物色度来测定磷酸(含量)。
(5)硫酸盐(OIV-MA-AS321-05A) 沉淀硫酸钡后,紧接着进行重量法测定。通过在盐酸中洗涤沉淀物消除同时沉淀的磷酸钡。在酿酒葡萄汁或葡萄酒富含二氧化硫的情况下,建议在密闭容器中煮沸进行脱硫处理。
(1)铵(OIV-MA-AS322-01) 将铵(阳离子)保留在弱阳离子交换树脂上,以酸溶液洗脱,蒸馏洗脱液,通过盐酸标准溶液滴定法测定馏出液中的氨。
(2)钾
a.OIV-MA-AS322-02A 在添加氯化铯以抑制钾的离子化后,原子吸收分光光度法直接测定经稀释的葡萄酒中的钾。
b.OIV-MA-AS322-02B 火焰光度法直接测定经稀释的葡萄酒中的钾。
注:重量法测定从葡萄酒灰分溶液中沉淀出的四苯硼钾,是一种测定钾的精确方法。
(3)钠
a.OIV-MA-AS322-03A 在添加氯化铯以抑制钠的离子化后,原子吸收分光光度法直接测定经稀释的葡萄酒中的钠。
b.OIV-MA-AS322-03B 火焰光度法直接测定经稀释的葡萄酒(至少1mL:10mL)中的钠。
(4)钙(OIV-MA-AS322-04) 在添加一种电离抑制剂后,原子吸收分光光度法直接测定经稀释的葡萄酒中的钙。
(5)铁
a.OIV-MA-AS322-05A 适当稀释葡萄酒,去除乙醇,原子吸收分光光度法直接测定铁。
b.OIV-MA-AS322-05B 经30%过氧化氢消解后,以铁(Ⅲ)态呈现的总铁还原成铁(Ⅱ),并通过生成显色的邻菲罗啉络合物定量。
(6)铜(OIV-MA-AS322-06) 原子吸收分光光度法测定。
(7)镁(OIV-MA-AS322-07) 原子吸收分光光度法直接测定经稀释的葡萄酒中的镁。
(8)锌(OIV-MA-AS322-08) 去除乙醇后,原子吸收分光光度法直接测定葡萄酒中的锌。
(9)银(OIV-MA-AS322-09) 将样品烧成灰烬后采用原子吸收分光光度法测定银。
(10)镉(OIV-MA-AS322-10) 石墨炉原子吸收分光光度法直接测定葡萄酒中的镉。
(11)铅(OIV-MA-AS322-12)
a.原子吸收光谱法 该方法可检测各种葡萄酒中的铅。葡萄酒通过匹配基质稀释,含有基体改进剂和葡萄酒模拟成分的基质匹配溶液加入被测葡萄酒和铅标准溶液中,石墨炉原子吸收测定。
b.原子吸收光谱法 除甜白葡萄酒需稀释外,样品无需准备。加入磷铵使酒中的铅在高温下保持稳定,消除干扰,使铅在标准溶液的光谱行为与酒中保持一致。通过装备焦耳效应的平台加热石墨炉使铅原子化,非特定吸收可以通过塞曼效应或氘灯校正,检测波长为283.3nm,外标法定量。
(12)多种矿质元素(OIV-MA-AS322-13) 电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测定葡萄酒中以下元素的浓度:钾(检测上限1500mg/L)钙(检测上限250mg/L);镁(检测上限150mg/L);钠(检测上限100mg/L)铁(检测范围1~10mg/L);铜(检测范围0.1~0.5mg/L);锌(检测范围0.5~5mg/L);锰(检测范围0.5~5mg/L);锶(检测范围0.1~3mg/L);铝(检测范围0.75~7.5mg/L);钡(检测范围0.1~5mg/L)。
采用1:5的稀释溶液制备样品,以便能够同时分析常量元素和微量元素。校准溶液包含2.5%乙醇,以便考虑雾化过程中,伴随稳定溶液用的硝酸(HNO 3 ,1%)在等离子体温度下出现的与之相关的基体效应。本方法中建议的谱线Sc 335.372 (钪5mg/L)和谱线Cs 697.327 (铯在CsNO 3 中为1%)可用作内标,以使其他非光谱干扰的影响最小化。如有更好选择,也可以用其他内标物来优化本方法,如:Y 371.029 。当CsNO 3 形式的铯用作内标物时,也可充当离子缓冲剂,同时为其他组分设置了电离平衡,氯化铯(CsCl)也可用作离子缓冲剂。在相同烧瓶中制备内标物和离子缓冲剂,从蠕动泵中添加第三个通道将其引入样品,再作为均质混合物进入喷雾器。仅分析常量元素时,还可按1:50稀释样品进行分析,向标准液和样品中加入硝酸(HNO 3 ,1%),以稳定溶液,考虑到已经稀释,基体效应可忽略不计,不必使用内标物,同样也无需在校准范围内添加乙醇。
(1)砷
a.OIV-MA-AS323-01A 蒸发乙醇,还原砷(Ⅴ)到砷(Ⅲ),然后以氢物发生原子吸收分光光度法测量葡萄酒中的砷。
b.OIV-MA-AS323-01B 用硫酸和硝酸消化后,借助盐酸中的碘化钾,砷(Ⅴ)还原成砷(Ⅲ),并用硼氢化钠将砷转化成砷化氢(H 3 As),生成的化氢由氮气携带,在高温下用无火焰原子吸收分光光度法测定。
(2)总氮
a.OIV-MA-AS323-02A 本方法可用于分析酿酒葡萄汁和葡萄酒中0~1000mg/L范围内的总氮。
可用杜马斯法分析有机基体内的总氮。这涉及基体在氧气中的总燃烧期,以铜还原燃烧产生的气体,然后干燥,再用通用检测器定量氮。
向940℃的燃烧管中注射样品和氧气,闪速燃烧,聚集环燃烧使温度暂时升高到1800℃,在银钴和颗粒状三氧化二铬上进行补充氧化和卤素捕集,还原氧化氮到N 2 ,并在700℃时以铜捕集硫组分和过剩氧。氦中的气体包括:N 2 、CO 2 和H 2 O,捕集未测量的成分,用无水高氯酸镁(颗粒状无水高氯酸镁)捕集H 2 O,烧碱石棉(二氧化硅上的氢氧化钠)捕集CO 2 ,用色谱分离大量摄取后可能存在的氮和甲烷,气体分析仪检测,信号采集和数据处理。
b.OIV-MA-AS323-02B 在催化剂的作用下,用硫酸将样品湿法灰化,再用滴定法测定过量氢氧化钠中和后释放的氨。
(3)硼(OIV-MA-AS323-03) 用旋转蒸发将样品体积减小一半,以去除葡萄酒中的酒精成分,然后将葡萄酒通过交联聚乙烯基吡咯烷酮柱保留色素成分,定量收集洗出液,在pH5.2时与甲亚胺-H络合显色,420nm波长处进行比色分析测定硼浓度。
(4)二氧化硫
a.OIV-MA-AS323-04A 游离二氧化硫定义为以H 2 SO 3 、HSO 3 形式存在于酿酒葡萄汁或葡萄酒中的二氧化硫,它们之间的平衡受pH值和温度的影响: ;总二氧化硫定义为以游离态或与其他成分相结合的形式存在于葡萄酒中的各种不同形式的全部二氧化硫的总和。
游离二氧化硫由一股空气流或氮气流携带,通过中性过氧化氢稀溶液起泡而固定、氧化,氢氧化钠标准溶液滴定法测定生成的硫酸。在低温(10℃)下可去除葡萄酒中游离二氧化硫,高温(接近100℃)下可去除葡萄酒中总二氧化硫。
b.OIV-MA-AS323-04B 以碘直接滴定法测定游离二氧化硫,随后在碱性水解后碘量滴定法测得结合二氧化硫,加上游离二氧化硫,得到总二氧化硫。
c.OIV-MA-AS323-04C 通过pH值、酒精度和温度之间的函数计算得出游离二氧化硫中H 2 SO 3 的百分比。
d.OIV-MA-AS323-05 适用于葡萄汁的程序(Resolution Oeno 377/2009)。
(5)汞(OIV-MA-AS323-06) 本方法适用于分析葡萄酒中浓度范围在0~10 μ g/L之间的汞。
在酸性条件下将葡萄酒消化:将烧瓶连接至垂直、开口的利比希冷凝器进行回流加热,用高锰酸钾进行消化,用盐酸羟胺还原没有反应完的高锰酸钾,用氯化亚锡(Ⅱ)还原汞(Ⅱ)到原子态汞,在环境温度下,用氩气作载气,在波长254nm处,原子荧光光谱法测定单原子汞蒸气。汞蒸气灯激发汞原子,回到基态时发射出特定波长的荧光,该荧光可以用光电探测器定量汞的存在,并在消除记忆效应的同时获得良好的线性。
蠕动泵吸收氯化亚锡溶液、空白溶液(含1%硝酸的去离子水)和消化后的葡萄酒样品,用氩气流将汞金属收集到气液分离器中,通过干燥管后,用荧光检测汞;然后,将气流通过高锰酸钾溶液以捕集汞。
(6)多种元素(OIV-MA-AS323-07) 本方法可用于分析葡萄酒中存在的多种元素,各元素测定范围为:铝:0.25~5.0mg/L;硼:10~40mg/L;溴:0.20~2.5mg/L;镉:0.001~0.040mg/L;钴:0.002~0.050mg/L;铜:0.10~2.0mg/L;锶:0.30~1.0mg/L;铁:0.80~5.0mg/L;锂:0.010~0.050mg/L;镁:50~300mg/L;锰:0.50~1.5mg/L;镍:0.010~0.20mg/L;铅:0.010~0.20mg/L;铷:0.50~1.2mg/L;钠:5~30mg/L;钒:0.003~0.20mg/L;锌:0.30~1.0mg/L。
该技术还可用于分析其他元素。有时需要消解样品,例如含糖量超过100g/L的葡萄酒,需要先消解样品,这种情况下建议用硝酸进行微波消解。该技术还可用于测定消解后的酿酒葡萄汁。
向高频等离子体中注射并雾化样品,等离子体使样品中的元素去溶剂化、雾化和离子化,用配备离子透镜组的真空系统提取离子,离子在质谱仪(如:四极杆质谱仪)中按质荷比分离,用电子倍增器检测和定量离子。
(7)杀虫剂(OIV-MA-AS323-08) 本方法采用QuEChERS(快速、简便、低廉、高效、稳定和安全)法提取葡萄酒中的杀虫剂残留并用GC-MS和或LC-MS/MS分析。
用乙腈萃取样品,添加硫酸镁和氯化钠液-液分离,并用柠檬酸盐缓冲,用氨基吸附剂(用PSA和硫酸镁进行分散固相萃取)纯化提取物。为了提高储存过程中的稳定性,添加少量甲酸使提取物酸化,用GC-MS和LC-MS/MS直接测定最终提取物。仅使用LC-MS/MS进行分析时,不必进行分散型固相萃取。
(8)纳他霉素(OIV-MA-AS323-09) 本方法描述了测定葡萄酒中纳他霉素(匹马菌素)的分析过程。纳他霉素的水平以每升葡萄酒中的微克数表示( μ g/L)。已经实验室内验证了5~2600 μ g/L浓度范围纳他霉素的溶剂空白及添加、红葡萄酒和白葡萄酒。
a.液相色谱高分辨质谱联用测定葡萄酒中的纳他霉素(匹马菌素) 将样品直接注入配备高分辨质谱检测系统的液相色谱仪(LC-HR/MS)来测定葡萄酒中的纳他霉素。采用标准加入法进行定量,首先分析样品得到一个估计的纳他霉素浓度,然后加入与样品中浓度相当的分析物重复分析。
b.HPLC/DAD测定葡萄酒中的纳他霉素(匹马菌素) 将非含气葡萄酒样品直接注入HPLC系统,对含气葡萄酒,先过滤或超声脱气。在C 8 柱上将分析物从基质中分离,含分析物的馏分自动转移到C 18 柱作进一步分离,在304nm和319nm检测纳他霉素,外标法定量。
(9)邻苯二甲酸酯(OIV-MA-AS323-10) 以异己烷萃取样品,通过蒸发浓缩提取物,用氘代内标法以气相色谱-质谱法分析浓缩过的提取物。