第五章 其他类型电镜简介

电镜种类较多，除透射电镜外主要有扫描电镜、超高压电镜、专用分析电镜、扫描透射电镜、场发射扫描电镜、光学电镜（医用诊断电镜）等。但就其基本类型来说，有透射电镜和扫描电镜两种类型，其他各型不过是在这两型基础上一方面的改进或是这两型的结合运用。目前发展主要趋势是提高分辨本领、提高镜筒真空度、提高自动化程度以及进行综合分析；此外向简易、小型、价廉的普及型电镜等方面的发展也日益受到重视。现仅就超高压电镜、低压显微镜、专用分析电镜、高分辨率的扫描透射电镜、环境扫描电子显微镜、扫描探针显微镜作以简介。

一、高压及超高压电镜

常规电镜的加速电压一般为100kV左右，200kV以上的透射电子显微镜称为高压电镜，大于500kV的称为超高压电镜，超高压电镜首先是由法国建成的，加速电压为1 MV，目前世界上已经建成了数台3 MV的高压电镜，美国正在筹建15 MV的高分辨率超高压电镜，而日本正在建造一台10MV的超高压电镜。最初高压、超高压电镜主要应用于材料科学等方面，最近为了观察“活显微组织”和“活”细菌，在生物学领域中也引起人们的重视，高压电镜的基本原理与常规透射电镜相似，但体积却要大得多，一般相当于2～3层楼房那样高，结构也很复杂。

高压或超高压电镜有下述特点：

（1）应用超高电压，可以获得高能电子束，样品对电子的散射截面随着加速电压的增加而相对减小，因而增加了电子的穿透能力，高能电子束可以穿透较厚的样品。常规100kV电镜中的样品厚度一般不超过100 nm，而在1 MV高压电镜中的样品厚度可接近10μm。因此，对样品制备非常有利，特别是难以制成超薄片的金属样品。

（2）常规电镜中厚样品引起的色差是影响分辨率的主要因素之一，而高压电镜的电子束穿透力很强，因此，随加速电压的增加，有效波长的缩短，色差随之降低可达更高分辨本领，如电压提高10倍，分辨本领可提高2倍。

（3）高加速电压下散射截面变小，电子束和样品间作用减少，因而样品辐射损伤减少。如将100kV电压提高到1 000kV，辐射损伤减少3倍左右。

（4）因为高压电镜的景深很长，所以用高压电镜观察时，厚样品中不同平面的细节均可清楚地成像在同一平面上，有利于立体像的拍摄，便于获得更丰富的三维结构信息。

（5）高压电镜的样品室一般为环境样品室，因而有可能观察活体生物样品，这对生物医学研究有着广阔的前景，目前已经取得了一些成果，如培养细胞、血细胞方面的研究。为观察样品的生命状态，将样品放在含水和适当气体的环境试样室，可于短时间内对其进行动态观察，如在短时间内可研究细胞器的运动过程。1972年Parson等曾报道用800kV超高压电镜观察湿的肿瘤细胞样品。

超高压电镜已显示了很大的优越性，但体积庞大，结构复杂，价格昂贵。如法国土鲁斯实验室一台超高压电镜，仅透镜质量就近1 t，需放在特制的二层楼建筑内。目前200kV高压电镜的性能已不断完善，商品数量也在增加，这种电镜的应用越来越广泛。但是由于价格很高，而且维护困难，所以一般只在国家级的研究中心应用。

二、低压电子显微镜

高压电镜电子束具有很强的穿透力，因而能使样品减少辐射损伤并能提高分辨率，但高压电镜使样品的反差明显减弱，这对生物样品大为不利。因而人们提出了使样品辐射损伤降低而反差增强的低压电镜。目前，可在加速电压为3 kV时获得1 nm的分辨率。

透射型低压电镜目前很少，主要是在SEM上配置低压装置，称高分辨率低压扫描电镜。最近已经研制出一种新型的减速低压电镜，在4kV的工作电压时可获得2.5 nm的分辨率。之所以成为减速低压电镜，是因为从灯丝发射出来的电子受到阳极40kV加速之后，便逐渐减慢，当电子到达样品时，电压减低到只有3～5 kV，而在穿透样品后，到达荧光屏时，电压又重新增加到40kV。这种低压电镜因具有中间减速的特征，所以不仅样品有足够的成像反差和较小的辐射损伤，而且图像又具有适当的亮度，这确实有利于生物样品的研究。

三、专用分析电镜

透射电镜与扫描电镜都不能精确指出标本的化学成分。分析电镜则能在观察形貌的同时研究细胞或组织内元素的种类、分布和含量。

前已述及电子探针和样品相互作用可引出多种信息。利用其中某些信息，如特征X线、俄歇电子等经过处理可对样品组成元素进行定位、定性、定量分析。特征X线是每种元素特有的，因每种元素均有一定的X线谱系。当电子探针扫描至样品某部位，作用于某原子时，即可把该原子低能内层轨道的电子轰击到能量较高的外层轨道上，或脱离原子，此时原子发生电离，使能量较高的外层电子立即迁跃到低能内层轨道上以填补空位，此时该电子能量降低，其高出的能量以特征X射线形式释放出来（图5-1）。特征X线信息收集和处理的仪器称为X线能谱仪或X线波谱仪，把这种仪器与专用的高分辨率的透射电镜（有3个聚光镜）相结合即成专用分析电镜或专用电镜分析仪。

分析电镜的检测方法有两种。一种是波谱分析方法（晶体衍射法），波峰的峰值反映X射线的强度，根据射线的强度可反映元素的含量。另一种称为能谱分析法，直接用检测器接受X射线量子，将它转变为电信号加以放大，并进行脉冲幅度的分析，脉冲的高度代表元素的相对含量。利用分析电镜可在电镜检测细胞微小区内的元素性质、含量和分布，如测定细胞内的Na，K，Ca，Fe，P，Cl等及某些微量元素的含量和分布变化，以探讨各种元素与组织细胞的生理与病理关系。

目前，专用分析电镜甚少，但一般扫描电镜或较高级透射电镜均可安装X线能（波）谱仪附件，故也可进行微区元素分析。虽然性能差一些，但应用却极普遍。

这种电子显微镜的优点是进行元素分析的同时，可做样品形貌观察（透射电子扫描图像或二次电子扫描图像），并且在分析过程中不破坏细胞结构，各元素能保持原位分布。其次是灵敏度高，可测出1μm ³ 区域内质量为10g的元素量，但在分析低原子序数的元素（低于钠原子序数）方面尚存在问题，并且在生物样品制样过程所产生元素的扩散、移位也有待进一步解决。

四、高分辨率的扫描透射电镜

扫描透射电镜是20世纪70年代初期由美国芝加哥大学首先研制出来的一种新型电镜，其工作原理居于扫描电镜和透射电镜之间，既有扫描电镜和透射电镜的优点，又弥补了它们各自的缺陷。其最初设计是为了观测单个的重原子。STEM的基本构造与扫描电镜大致相同，即有数个聚光镜而没有成像透镜，不同的是二次电子检测器位于样品的侧上方而透射电子检测器位于样品的正下方。扫描透射电镜在样品下方可有汇聚透镜。

扫描透射电镜的原理是通过电子探针在薄样品上扫描，穿过样品的扫描透射电子被样品下方的透射电子检测器接收，再将输出信息放大，运至显像管即可显示出扫描透射电子像。扫描透射电子的数量与样品各部位的质量厚度相关，因此可在显像管荧光屏上看到与透射电镜一样的图像。

其放大倍率与扫描电镜一样取决于显像管长度与样品上扫描长度之比。其分辨本领由聚焦在样品上电子探针的直径（光斑直径）决定，直径越小分辨本领越高。

扫描透射电镜有两种类型，一是专用型，一是附件型。后者是在高性能透射电镜上加装扫描透射电子检测器，其分辨本领较低。

扫描透射电镜近年来发展迅速，成为唯一不需染色、固定或屏蔽而能够直接观测单个生物分子的仪器，所产生的图像是在焦距处以数字方式记录下来的，因此可以直接解释分析。扫描透射电镜的工作电压为40 kV，电子束大小为0.25 nm，分辨能力可达0.25 nm，但通常冷冻干燥样品的分辨率有2 nm左右，主要因为电子束辐射损伤的缘故，特别高的分辨率可在染色样品上得到，染色样品所受损伤比冷冻干燥样品少，在材料学应用得较多。

目前世界上扫描透射电子显微镜不多，安装在Brookhaven国际实验室的扫描透射电镜是世界上为数不多的专门用于研究生物学样品的设备之一，被大量用来研究病毒及某些蛋白的结构。

目前广泛使用的STEM主要分两类。

一是超高真空的场发射式电镜。现在一般提到的STEM，主要指Crewe等采用的场发射电子枪式的扫描透射电镜。在SEM中限制分辨本领的是信噪比，因此电子束的强度不能太弱（SEM中的束流比TEM中的束流大好几倍）。一般的发叉型钨丝提供的极限亮度只能使分辨率达到2nm左右。而利用场发射电子枪则可以获得很高的亮度（一般可达10 ^-10 ～10 ^-8 Å/cm ² 立体弧度），比发叉型钨丝高3～4个数量级，可获得的分辨率为0.2～0.3 nm，已接近透射电镜的分辨率。但这种场发射电子枪必须处于超高真空，灯丝是单晶钨针尖，这是一种最具发展前途的电镜。场发射型电子枪的扫描透射电镜造价极高。

二是附加在透射电镜或扫描电镜上的STEM。这种STEM为附件型，一般附加在SEM或TEM上，其分辨率较低，如是透射电镜附件型，分辨率一般可达1.0～1.5 nm；如是扫描电镜附件型，分辨率一般只有4～6 nm。这种附件型STEM主要用于X射线能谱、波谱分析或电子损失谱分析，用以观察元素的分布图。

STEM具有以下的优点：①照射面积小，热损失和辐射损失小，可以直接观察到铀和钍等原子像。②在观察较厚样品和低反差样品时，电子经过较厚样品引起的能量损失不会形成色差及影响图像分辨率，可以观察到在透射电镜中难以观察的低反差生物样品。③能同时收集透射和散射电子，并同时显像。可同时观察明场和暗场，并进行适当的处理和比较。④由于处于超高真空的工作状态，所以大大减少了样品的污染，有人曾成功地在同一区域拍摄了700张有关原子的连续照片。如把这所有的照片叠放在一起，就能分析原子的时差。

尽管STEM优点很多，但由于造价昂贵，所以在相当长的一段时间内，不可能达到TEM，SEM那样的普及程度，只能作为透射电镜或扫描电镜的附件，与其构成分析电镜，从而得到广泛的应用。

五、环境扫描电子显微镜

环境扫描电子显微镜所指环境并非真正意义上的大气环境，与传统的SEM样品室高达10 ^-6 ～10 ^-3 Torr的真空度相比，ESEM样品室的真空度为1～20Torr，非常接近大气环境，但又不等同于平均760Torr的大气环境。在环境扫描电镜出现以前，电镜研究用的生物样品均要经过固定、脱水等处理，以使电镜光源——电子束在高真空中穿透或扫描样品而成像。这种研究方法观察到的生物样品结构是死的、非实时的。因而，限制了电镜在生物医学中的应用。1995年以后，国外推出了样品室压力在常压下的环境扫描电镜，可在几乎接近常压下观察生物样品，可以观察活体生物成长发育时的超微结构变化。环境扫描电镜的出现，弥补了电子显微镜最致命的弱点，即不能像光镜那样观察活体生物样品，因而可以预言，环境扫描电镜的出现，将使电镜在生物医学研究中产生惊人的飞跃。环境扫描电镜的优越性是显而易见的，如：在转基因研究中，采用经典的受精卵显微注射技术，随机性较强，用生精小管导入法只能做小鼠和大鼠，其他动物的生精小管由于看不清楚而无法注射。若在环境扫描电镜下操作，就使其成为可能。

六、扫描探针显微镜

扫描探针显微镜是一类全新的显微镜总称。包括了十几种类型：扫描隧道显微镜、原子力显微镜、扫描电容显微镜、扫描光子显微镜、扫描热显显微镜、扫描离子显微镜、扫描声学显微镜、摩擦力显微镜、磁力显微镜。在生物医学中得到广泛应用的当数扫描隧道显微镜及原子力显微镜。

目前，常规的电子显微镜在分辨率及放大倍数方面已经接近它的极限。其原因在于电子光学的一些缺陷限制了电镜分辨率的进一步提高。1982年IBM商业机器公司欧洲研究实验室的两位德国科学家以量子力学中的隧道效应理论为基础，研制成功了表面垂直方向分辨率达0.005 nm的扫描隧道显微镜，将人类的观察力提高了近两个数量级，使人类第一次可以随心所欲地操纵、排列原子。

（一）扫描隧道显微镜

扫描隧道显微镜是在导电样品和金属探针之间加上一个微小电压（2 mV～2V），当针尖和样品表面之间的距离接近1 nm左右时，针尖的电子云和样品表面的电子云放生重叠，由于量子隧道效应，在探针和样品表面之间会产生隧道电流。隧道电流与探针到样品表面的距离成指数函数关系，故隧道电流对间距变化反应十分敏感。STM横向分辨率为0.2 nm，但纵向分辨率高达0.005 nm。因此，可获得高精度的三维图像。STM在生物科学领域的应用包括：病毒和细菌研究、染色体、细胞膜、微管和胶原、配体-受体连接、DNA和RNA分析、蛋白质-核酸混合物研究、蛋白质和肽、分子晶体、聚合物和生物材料研究等。例如：利用STM可研究染色体定位、转录、转移和小分子DNA交互作用，对DNA-RNA聚合酶复合体、葡萄球菌败血蛋白结合的生物素基PCR小片段等进行深入分析。

（二）原子力显微镜

原子力显微镜工作时，探针距样品很近时，探针尖端的原子同样品表面的原子产生相互作用，该相互作用使微悬臂发生形变或使其运动发生变化，这一变化可用电学或光学方法探测出来，变化的大小反映相互作用的大小。在探针下扫描样品，利用反馈系统的作用，在扫描过程中保持作用力恒定，测得探针对应于扫描各点位置的变化；或保持探针、样品间距不变，测得扫描各点探针、样品间相互作用力的变化，即可得到样品表面形貌。AFM在生物科学领域的应用包括：研究果蝇染色体和胶体金标记的质粒DNA，观察肾上皮细胞的细胞骨架结构、浆膜浅凹、浆膜小斑、观察血小板的运动、观察水中活的或固定的哺乳动物细胞表面的骨架结构、在空气中观察大肠杆菌和中国仓鼠卵巢细胞、对DNA分子链上的任何确定部位进行分割及蛋白质和小分子成像等。 M+8t1Z4Evp/03lsdedjyiWtkjk0WeCniJkVTcD+rGqVgqtSoYBhVYj7b8tjLsdsD