第四章 扫描电子显微镜

扫描电子显微镜（SEM）以电子束为照明源，将聚集的很细的电子束（电子探针）以光栅状扫描的方式照射在样品上，激发样品产生相关信息，通过收集和处理，以类似电视摄影显像的方式，获得样品表面的微观形貌。扫描电镜在生物学领域主要用于观察样品的表面形貌及细胞断面上的结构。扫描电镜与透射电镜有许多相似之处，本章仅对扫描电镜的结构、特点和应用作以简述。

一、扫描电镜的结构

扫描电镜的结构主要有电子光学系统、信号检测放大系统、图像显示和记录系统、真空系统、冷却水系统和电源供给系统等组成（图4-1）。扫描电镜也由电子枪发射电子束，但无成像放大电子透镜，其成像放大原理类似电视机。

（一）电子光学系统

电子光学系统由电子枪、电磁透镜、扫描线圈及样品室等组成，位于高度真空的镜筒内。

1.电子枪

电子镜位于镜筒最上端，由三极电子枪（阴极、阳极和栅极）发出电子束，经栅极静电聚焦后成为直径50μm的电光源。电子枪的种类不同，产生的电子束汇聚直径和能量强度也不同。扫描电镜的电子枪主要有两大类：

一类是利用场致发射效应产生电子，称为场致发射电子枪。这种电子枪的阴极为金属，尖端做成小于0.1μm的尖锐形状，即发射极。在金属表面加强电场，金属表面的势垒变浅，由于隧道效应，金属内部的电子穿过势垒从表面释放，这种现象叫场发射。这种电子枪的亮度很高（是六硼化镧灯丝电子枪亮度的100倍），电子束斑尺寸小，电子枪的能量发散度也低。但是价格昂贵，而且需要小于10 ^-10 torr的极高真空，但寿命能达1 000h以上，且无须电磁透镜系统。

另一类是利用热发射效应产生电子，有钨枪和六硼化镧枪两种。钨枪寿命为30～100h，价格便宜，成像不如另外两种明亮，常作为廉价或标准扫描电镜配置。六硼化镧枪寿命介于场致发射电子枪与钨枪之间，为200～1 000h，价格约为钨枪的10倍，图像比钨枪明亮5～10倍，需要略高于钨枪的真空，一般在10 ^-7 torr以上，但比钨枪更易产生过度饱和和热激发等问题。

2.电磁透镜

热发射电子枪需要由电磁透镜来集结成束，所以用热发射电子枪的扫描电镜必须配有电磁透镜，通常会装配两组：汇聚透镜和物镜。汇聚透镜用于汇聚电子束，装配在真空柱中电子枪下，通常不止一个，且有一组汇聚光圈与之相配。汇聚透镜仅用于汇聚电子束，与成像聚焦无关。物镜为真空柱中最下方的一个电磁透镜，负责将电子束的焦点汇聚到样品表面。在物镜与样品之间留有一定空间，以便安装各种探测器。扫描电镜通过两个聚光镜和一个物镜，将电子枪发射的电子束汇聚成极细的电子束，束斑约为5 nm或更小，又称电子探针，聚焦于样品表面。因此，扫描电镜的电磁透镜不具有成像透镜的作用，而是将直径约50μm的电子束斑汇聚成极细的电子探针。

3.扫描线圈

在末级透镜（物镜）上方装有扫描线圈，在它的作用下，电子探针在样品表面扫描。扫描线圈有互相垂直的X轴和Y轴两个方向，从左到右方向的扫描称行扫描、水平扫描、线扫描；从上到下方向的扫描称帧扫描、垂直扫描。在线圈中通以随时间而线性改变强度的电流，又称锯齿波电流，实现电子探针在样品表面的逐点扫描。由于作用在样品上的扫描和电视显像管上的扫描由同一个扫描发生器控制，所以电子探针在样品上的扫描动作和显像管上的扫描动作严格同步，从而保证电视上的图像完全显示样品的形貌（图4-2）。

电子探针打到样品上与样品相互作用，会产生二次电子（也称次级电子）、背反（散）射电子、俄歇电子以及特征X射线等一系列信号（图4-3）。

射入样品表面的电子，称一次电子。一次电子在穿透和散射过程中，与样品原子相互作用，进行能量交换，使一部分原子的外层电子被激发而逸出表面，称为二次电子。二次电子来自表面5～10 nm的区域，它对样品表面状态非常敏感。由于二次电子的能量较小，在样品深处激发出的二次电子没有足够的能量逸出表面，因此，二次电子的发射与样品表面的形貌及物理、化学性质有关，故二次电子成像能显示出样品表面的细微结构。由于二次电子发自样品表层，入射电子还没有被多次反射，因此产生二次电子的面积与入射电子的照射面积没有多大区别，所以二次电子的分辨率较高，一般可达到5～10 nm。扫描电镜的分辨率一般就是二次电子分辨率。

电子探针与样品作用后，除产生二次电子外，还能引出多种信号，可用分别与其相应的探测器接收，便得到背反射电子像、吸收电子像等。如用特征X能（波）谱仪可分别检测特征X线，或用俄歇电子谱仪来检测俄歇电子，便可对样品进行微区元素成分分析。

4.样品室

样品室放置样品。样品台本身是一个复杂而精密的组件，它应能放置一定尺寸的样品，并能使样品平移、倾斜和转动等，以利于对样品的每一个特定位置进行各种分析。新式扫描电镜的样品室实际上是一个微型试验室，它带有多种附件，可以使样品在样品台上加热、冷却和进行机械性能试验。样品室内除放置样品外，也安置信号探测器。各种不同信号的收集和相应检测器的安放位置有很大关系，若安置不当，则可能收不到信号或收到的信号很弱，从而影响分析的精度。

（二）信号检测放大系统

电子探针与样品相互作用产生的二次电子、背反射电子、X射线等信号，分别被不同的接收器接收。这些信号都可采用闪烁计数器来进行检测，信号电子进入闪烁体后即引起电离，当离子和自由电子复合后就产生可见光。可见光信号通过光导管送入光电倍增器，光信号放大，即又转化成电流信号输出，电流信号经视频放大器放大后就成为调制信号，以调制显像管的亮度。

（三）图像显示和记录系统

由于经过扫描线圈上的电流与显像管相应偏转线圈上的电流同步，因此，当入射电子在扫描线圈的作用下沿标本表面逐点逐行扫描时，样品表面任意点发射的信号与显像管荧光屏上相应的亮点一一对应。也就是说，电子束打到样品上一点时，在荧光屏上就有一亮点与之对应，其亮度与激发后的电子能量成正比。因此。在荧光屏上形成样品表面的图像。

（四）真空系统

为保证扫描电子显微镜电子光学系统的正常工作，对镜筒内的真空度有一定要求。场发射电子枪的关键是在于有一个原子级的清洁发射表面，他们必须在超高真空条件下工作，典型的真空度为10 ^-7 Pa或更高。扫描电镜需要真空环境的原因如下：①电子束系统中的灯丝在普通大气中会迅速氧化而失效，所以使用扫描电镜时需要用真空，此外，真空柱平时需充满纯氮气或惰性气体。②真空环境可以增大电子的平均自由程，使得更多的电子用于成像。③对于任何一种发射体，在电子束由电子枪进入样品室的行程中，所经过的电子柱体的总长度必须在适当的真空条件下。否则不但会造成样品污染，还会出现灯丝寿命下降，极间放电等问题。

真空系统主要包括真空柱和真空泵两部分。真空柱是一密封的柱形容器，成像系统和电子束系统均内置在真空柱中，真空柱底端即为密封室，用于放置样品。真空泵用来在真空柱内产生真空，有机械泵、油扩散泵以及涡轮分子泵三大类。机械泵和油扩散泵的组合可以满足配置钨枪的扫描电镜的真空要求；对于配备场致发射枪或六硼化镧枪的扫描电镜，则需要机械泵和涡轮分子泵的组合。

二、扫描电镜的相关性能参数、特点及应用

（一）扫描电镜相关的性能参数

1.放大倍数

放大倍数是电子束在荧光屏上的最大扫描距离（线）和在样品上最大扫描距离（线）的比值。显像管上最大扫描线的长度即荧光屏的长度（一般为10 cm），若在样品上的扫描线长为100μm，则放大倍率为1 000。这个比值是通过调节扫描线圈上的电流来改变的，只要调节扫描线圈中的电流大小就能方便地改变放大倍率，而聚焦保持不变。

2.分辨率

分辨率是扫描电镜的主要性能指标之一，决定于电子探针和样品之间相互作用的有关因素。在理想情况下，二次电子像分辨率等于电子束斑直径，一般为60～100Å。

3.景深（场深）

扫描电镜的景深比较大，位于焦平面上下的一小层区域内的样品点都可以得到良好的会聚而成像，成像富有立体感，所以它特别适用于粗糙样品表面的观察和分析，可以用于纳米级样品的三维成像。

（二）扫描电镜的特点及应用

与其他电子显微镜比较，扫描电镜因观察时所用电子探针的电流小、束斑尺寸小（通常是5 nm到几十纳米）、能量也比较小（加速电压可以小到2kV），且是以光栅状扫描方式照射试样而不是固定一点照射样品，因此样品的电子照射面发生损伤和污染的程度很小，这一点对观察生物样品特别重要。

1.观察样品表面的三维立体结构

扫描电镜由于景深长、视场大、有较高的放大倍数、富于立体感，因此可用于观察较大体积或较厚的样品。而透射电镜由于切片超薄，故只能观察二维结构。扫描电镜的焦深比透射电镜大10倍，比光学显微镜大几百倍，其在观察厚样品时，能得到高的分辨率和最真实的形貌。尽管扫描电镜的分辨率介于光学显微镜和透射电镜之间，但在对厚块样品进行观察时，因透射电镜的标本需要采用复膜方法，而复膜的分辨率通常只能达到10 nm，且观察的不是样品本身，因此，用扫描电镜观察厚块试样更有利，更能得到真实的样品表面资料。

2.观察样品的各个区域的细节

扫描电镜由于工作距离大（可大于20 mm）、焦深大（比透射电子显微镜大10倍）、样品室的空间也大，因此样品在样品室中可动的范围非常大。可以让样品在样品室内以6个自由度运动（即三度空间平移、三度空间旋转），这对观察不规则形状样品的各个区域带来极大的方便。而光学显微镜和透射电镜的工作距离小，实际上只许可样品在前后、左右的两度空间内运动。

3.放大倍数可连续调节

扫描电镜的放大倍数可由10倍至20万倍连续调节。一次聚焦后即可从高倍到低倍、从低倍到高倍连续观察，不用重新聚焦。高倍观察时图像清晰，因放大倍数变化时焦距不变，景深基本也不变，因而观察和照相都很方便。

4.样品制备简单

扫描电镜可直接观察金属导电样品，非导电样品只需镀上金属导电碳膜即可观察。由于扫描电镜的景深长，样品室大，能够直接观察直径100 mm，高50 mm，或更大尺寸的样品，而且对样品的形状没有任何限制，粗糙表面也能观察，这免除了样品制备的麻烦，而且能真实观察样品本身不同的物质成分（背反射电子像）。

5.易对样品进行综合分析

扫描电镜可以获得样品的多方面资料：①扫描电镜不仅可以利用入射电子和样品相互作用产生的各种信息来成像，而且可以通过不同的信号处理方法获得多种图像的特殊显示，从而获得样品表面形貌的多方面资料。②扫描电子像不是同时记录的，它是分解为近百万个点依次记录构成，因而使得扫描电镜除了观察表面形貌外，还能进行成分和元素的分析，以及通过电子通道花样进行结晶学分析，选区尺寸可以从10μm到3μm。目前的扫描电镜多配有X射线能谱仪装置，可以同时进行显微组织性貌的观察和微区成分分析。

三、扫描电镜的图像特点

扫描电镜以荧光屏上图像不同的亮度，来反映物体表面形貌的凹凸不同，亮（电子密度低）的地方表面突出；暗（电子密度高）的地方表面凹陷。在观察扫描电镜的图像时，需要注意，图像上的亮度受以下两个因素影响：①电子束中的各个电子以几乎平行的方向打击样品表面，样品表面上不同的点受电子作用力的角度不同，激发出的二次电子的量也不同；②二次电子被固定位置的集电器所收集，由于入射角不同，二次电子向空中散射的角度也不同，因此进入集电器的二次电子的数量不同，进入集电器的二次电子数量是样品表面特征和入射角的函数。

此外，观察扫描电镜图像还应考虑以下两点：①原子序数的差异：原子序数越高的元素，二次电子发射强；反之原子序数越低的元素二次电子发射弱。②样品的边缘和尖端效应：导电性能差的样品经常容易产生充、放电现象；样品的电磁特性等也会造成二次电子发射量的差异和影响电子轨迹使之产生偏折。 pcYzURv8/ef+SpY1zSkXEppmlATJ5vO+gN2TTyp2eeIOqUqAeVQCKosdY2PLWqJ1