第三章 透射电子显微镜

一、透射电镜的结构

透射电子显微镜的结构十分复杂，包括镜筒和辅助系统。

（一）镜筒

镜筒由照明系统、样品室、成像放大系统和观察记录系统组成。镜筒内主要有电子枪、电子透镜、样品架、荧光屏和照相机构等部件，这些结构通常是自上而下地装配成一个柱体（图3-1）。

1.照明系统

照明系统包括电子枪和聚光镜。

（1）电子枪是各种形式电镜的电子源。位于镜筒顶端，由阴极-控制极-阳极构成三级电子枪，是用来发射电子束的重要装置，也是控制电子显微镜成像亮度和稳定度的重要设备，因此电子枪的好与坏对电子显微镜的质量最密切相关。阴极的材料常用金属钨，钨灯丝具有稳定和制备工艺简单等特点而被广泛应用。通常用0.1～0.12 mm的钨丝制作成V形，在钨丝的两端加电压，当灯丝的温度达到2500～2800K时，发射较强密度的电流，并且其产生的热电子发射可以形成很强的照明电子束。控制极即栅极位于阴极和阳极之间。栅极负电位使部分电子返回阴极，以减少电子束的总发射量，并控制成像的亮度。栅极电位越负，照明亮度越暗。栅极在阳极孔附近将电子束汇聚成小于100μm的光源截面，称为电子枪交叉点，而后再发散。在交叉点处可以获得较强的电流密度，电子束光斑的尺寸即电子枪交叉点的尺寸。因而，栅极起控制电子束发射和改变电子枪电场分布的作用。电子束流大小与灯丝加热温度、栅极电压高低及灯丝与栅极孔之间的距离有关。阳极位于阴极对面，处于零电位。在阴极和阳极之间有-20～100kV的电位差，使阴极发射的电子加速从阳极孔穿出。

（2）聚光镜将电子枪发射的电子束汇聚于样品平面，并调节样品平面处的电子束孔径角、电流密度和照明光斑大小（图3-2）。

照明系统能提供最大亮度的电子束，照射在样品上的电子束孔径角可以在一定范围内调节，使照明光斑的大小符合要求。若光斑过大，将使样品受热产生热漂移和污染。为解决上述问题，通常使用双聚光镜系统。第一聚光镜是短焦距的强磁透镜，使电子枪交叉点强烈缩小成像；第二聚光镜是长焦距的弱磁透镜，将交叉点缩小像再次成像于样品表面。一般电镜中，第一聚光镜缩小率几十倍至100倍，第二聚光镜缩小1～2倍。由于第二聚光镜的焦距较长，在其与物镜之间可以放置多种附件。第一聚光镜中有固定光栏，第二聚光镜中有可动光栏，可更换不同的孔径，改变照明孔径角。孔径角越大，像的球差越大，引起像的模糊；孔径角较小时，使照明亮度降低，产生衍射像差。因此，在电镜使用时要选择合适的孔径光栏，得到最佳孔径角。第二聚光镜中还装有消像散器，从而消除轴上像散，获得圆形照明光斑。实际工作中，调节第二聚光镜的电流可以改变照明亮度。

2.样品室

样品室包括样品台、样品架、预抽室及传送机构（图3-3）。样品台承载样品，使样品在垂直于光轴的相互垂直的平面上做横向移动。样品架又称样品杯，放置铜网。在预抽室的两端有隔离阀门，在更换样品时，阀门关闭，使样品室的压力与周围环境的大气压一致，而不破坏整个镜筒的真空。传送机构又称机械手或样品杆，固定样品架，并将样品架从预抽室送达到镜筒。

3.成像放大系统

电镜的透镜为电磁透镜，电镜的中央实际上是空的，并没有透镜，只是利用轴对称性弯曲磁场使电子束产生聚焦的效应，与透镜的聚光相似，故称电磁透镜。其工作原理是：电子枪发射出的电子束波动前进，经过电磁透镜后则变成向右呈螺旋状依光轴前进，由很稳定的直流励磁电流通过带极靴的线圈产生的强磁场，使电子束聚焦。电子束透过标本后，再经过电磁透镜系统，此时标本上超微结构已经得到不同程度的放大。电镜通过改变磁场的电流强度改变透镜的焦距，从而调节放大倍率。

高精度的透射电子显微镜有多个电磁透镜，分别是物镜、中间镜及投射镜（图3-4）。

物镜是决定电镜分辨率的关键部件，物镜的放大倍率一般为100倍，直接放大标本中的结构细节，因此，它在成像上的任何微小缺陷都会被其他透镜进一步放大。物镜是短焦距的强磁透镜，调节物镜电流，实际上起调整焦距作用。在物镜的下焦面处有可更换的不同孔径的物镜活动光栏（其作用是限制物镜孔径角，提高像的反差），消像散器和样品。

通过物镜聚焦形成的中间像，下面有一个或二个中间镜及投影镜。中间像经过中间镜和投影镜进一步放大并把像投在荧光屏或照相底片上。

中间镜是倍数可变的弱磁透镜，放大倍率在20倍左右。在中间镜内装有光栏，同时配置了可改变线圈电流的装置，调整中间镜的电流即可以控制电镜的放大倍率。中间镜一般分为第一中间镜和第二中间镜。放大倍率低时，可关掉中间镜和投影镜，只用物镜放大；或者只关掉第二中间镜。

投影镜位于镜头最下方部分，是短焦距的强磁透镜，可放大100倍左右。

4.观察记录系统

观察记录系统，包括观察室和照相室。

由于电子束肉眼不可见，因此在观察室内装有一荧光屏，在高速运动的电子束的轰击下可激发出可见的荧光，使电子像转化为肉眼可见的可见光图像。视窗为有一定厚度的铅玻璃，防护X射线损伤。

荧光屏可作为照相快门，当需要照相记录时，可将荧光屏中央部位的小荧光屏活动板翻起90°，图像即直接投在照相底片上。照相底片位于荧光屏下的照相室，其上也有隔离阀门，在取换底片时会关闭，不影响其余部分的真空度。当需要观察典型的细微标本结构时，可以在观察窗外加装一个双光学放大目镜，这样可以将荧光屏上的像再放大10倍，更便于仔细观察。

（二）辅助系统

透射电镜的辅助系统可大致分为六大系统，即真空系统、冷却系统、供电系统、电子光学系统、操作系统、图像观察记录系统。

1.真空系统

由于空气对电子束的阻挡十分严重，因此在制造电子显微镜中，首先要求电子枪及电子束的通路必须是高度真空的。在每次电镜使用时都要抽真空。一般要抽真空达到10 ^-5 托（1托＝1 mmHg）。

真空系统是由机械泵、扩散泵（分子泵）、镜筒、管道、温度传感器、真空传感器、阀体和空气压缩机等组成，通过抽气管道与镜筒相连接。真空系统的工作是由固化的程序电路严格按程序控制的，是透射电子显微镜最重要的部分之一，决定了高压电路和灯丝能否工作。机器泵用于抽低真空和对扩散泵的预抽，扩散泵（分子泵）是用于实现镜筒的高真空，管道是气体流动通道，温度传感器是反馈电路上的关键部件，确定扩散泵的工作状态和冷却水平，真空传感器是检测镜筒关键点处的真空度水平，也是真空系统的关键部件，阀体是隔断或开启不同部位的真空通路，是分段抽真空的保证，阀体一般采用空气动力电磁阀，因此，透射电子显微镜都配有空气压缩机。

2.冷却系统

冷却系统是由冷却水或循环冷却水器，外接水管，内置水管，止水阀等构成。主要用于对扩散泵和透镜的冷却。对扩散泵的冷却是由其工作原理决定的，扩散泵主要是由加热器、扩散泵油和塔式冷却板构成，当扩散泵油被加热器加热沸腾后变成油蒸气，油蒸气上升过程中与空气结合后碰撞到塔式冷却板，立即变成液体回流到油池中，这样周而复始，逐渐把空气抽出来（图3-5）。塔式冷却板就是靠冷却水制冷的。透射电子显微镜的镜筒中有很多电子透镜，电子透镜在工作过程中产生大量的热量，热量的积蓄将影响透镜的工作稳定性和参数，所以，必须对每个透镜实施冷却，对高稳定性要求的测试还需要对重要透镜及其附属部件采用液氮冷却（图3-5）。

3.供电系统

电子显微镜离不开供电、细分为高压供电、加热供电、机械供电和信号供电等，由磁饱和稳压器、不间断稳压电源、高压油箱和低压电源箱等构成。电子显微镜对电的要求十分严格，决定了其工作的稳定性和寿命。高压是由独立的高压发生装置产生的，是电子显微镜的核心部件，高压的稳定性决定了电子显微镜的品质和寿命；真空系统的扩散泵设计有功率为600W左右的加热板，保障扩散泵油的循环工作；机械方面的供电是指为机械泵和空气压缩机工作提供电力；电子显微镜的电路部分包含大量的电路板，生成和传递各种控制信号，是弱电部分，也是要求数值极其准确的部分，由单体设计的低压电源箱提供电力。

4.电子光学系统

电子光学系统是透射电子显微镜的核心系统，相当于光学显微镜的光源、物镜、载物台、目镜等组成的系统，由电子枪、聚光镜、物镜、样品室、投影镜和观察室等组成。在真空系统工作正常的情况下，给电子枪施加需要的高压，高压稳定后，慢慢给灯丝通电，使灯丝产生电子，形成初期电子束，同时该电子束在高压的作用下形成高速电子束流，该束流在聚光镜和物镜的作用下，穿过样品室中的样品，然后由投影镜将光束透射到观察室的大荧光屏上或电荷耦合组件（CCD）的光束接受窗口上，就在荧光屏或显示器上看到样品的图像。

5.操作系统

随着电子和通信技术的发展，电子显微镜的操作越来越数字化和简单化，这也是电子显微镜发展史上变化最多、变化最快的系统，并逐渐由大量的按键和旋钮组成的操作面板，转化为由鼠标、键盘和少量旋钮和按键构成的操作系统，便于非专业人员在短时间内学会操作和使用。

6.图像观察记录系统

传统的图像观察和记录方法是荧光屏和胶片，随着现代技术的发展，目前一般采用荧光屏观察CCD记录的方法对图像进行观察和记录，甚至有的透射电子显微镜直接就用CCD记录和观察图像。透射电子显微镜配置的CCD按照安装方式分底插式和侧插式，适合不同的需求，一般生物医学领域使用侧插式，具有保留底片照相系统和视野大的特点；底插式则适用于材料科学的领域，CCD具有分辨率高，视野小的特点，但是不能与底片照相系统共存。CCD的分辨率水平取决于实际需要和经济能力。

二、透射电镜与光镜在结构、性能和操作方面的若干差别

（一）结构区别

1.外观结构

透射电子显微镜与普通光学显微镜的大小和外观结构差距巨大，虽然就其成像基本原理是一致的，但由于光源质的变化导致透射电子显微镜的复杂和体积庞大。

2.光源不同

显微镜的分辨本领是由光源的波长决定的，大概是波长的1/2，普通光学显微镜使用的是自然光或者是单色可见光光源，可见光的波长较长，其波长范围0.39～0.76μm，紫外线波长范围0.013～0.39μm，因此，可见光的分辨本领为0.2μm，透射电子显微镜一般采用80，100，200 kV等加速电压，对应产生电子波的波长是0.041 8Å，0.037 0Å，0.025 1Å，使得透射电子显微镜的分辨率达到2Å以上，高分辨透射电子显微镜采用300kV以上的电压，采用更稳定的场发射电子枪，其分辨率可以小到1Å以上，光源的不同才是光学显微镜和透射电子显微镜巨大差别的本质原因。

（二）合轴对中

光镜的聚光镜、物镜、目镜甚至光源在出厂时一般已对中合轴，平时操作时，不需要调整；而电镜的合轴对中需要使电子束中心与各透镜轴和各光栏之间相互重合。由于灯丝的热变形引起电束变化、调节各透镜电流搭配、更换工作模式等原因会使合轴受到破坏，在操作中经常需要调整。商品电镜都有各自的经验合轴方法，一般可通过机械方法和电气补偿装置进行合轴对中。

（三）放大倍率和聚焦

一般光学显微镜采用的是固定放大倍数的目镜和阶梯放大倍数的物镜组成的放大体系，所以，总的放大倍数是有限的几个固定的倍率。透射电子显微镜有所不同，由于结构设计和电子技术介入的原因，透射电子显微镜可以设计更多的阶梯放大倍数，可以从几十倍到百万倍调节，甚至可以是无级放大倍数，即放大倍数无级可调。普通光学显微镜采用的机械螺旋旋钮调整焦距，比较粗糙，精密性低，稳定性好；电子显微镜采用的是电磁物镜聚焦，精密度高，敏感性强，但是如果物镜线圈中的电流不稳或收到意外干扰容易产生飘逸。

（四）反差和成像

普通光学显微镜图像的反差即对比度是由样品本身的特点和制样方法决定的，光学显微镜本身也可以通过对入射光光圈调节来提高或降低图像的反差，但是，会影响到图像的亮度；透射电子显微镜图像的反差除了与样品本身特点和制样方法有关外，还就可以通过物镜光栏、物镜极靴、电子束光斑大小的电子控制等来调节对比度，也会牺牲一部分亮度，但可以通过改变其他功能作用予以补充。

普通光学显微镜的成像过程是光通过光圈后照射到样品上，透射光通过物镜进入目镜，人眼从目镜看到一个放大了的图像，这是一个虚像，由可见光光路成像原理决定的，改变物镜镜头即物镜的放大倍数，就可改变图像的放大倍数。透射电子显微镜成像过程是电子枪产生的电子束经聚光镜汇聚和固定光栏片的修正，下行后经物镜的聚焦和活动光栏的修正，照射在样品上，透过样品的电子束就携带了样品的结构信息，经过投影镜的放大直接照射在荧光屏上或CCD的接受器上，就在荧光屏上或CCD的监视器上看到样品的真实图像。

（五）样品制备

普通光学显微镜与透射电子显微镜样品的制备方法区别很大（表3-1）。

（六）仪器对样品的影响

普通光学显微镜对样品几乎没有什么影响，但是透射电子显微镜对样品有一定的影响。由于后者使用的是高速电子束流作为光源并直接穿过样品，高速电子束流具有一定的能量，加速电压越高，能量就越强。另外，生物材料的热耐受力较弱，高加速电压下，长时间照射，大亮度照射样品的同一部位，明显会对被照射部位的样品结构造成损伤。因此，选择加速电压时要依据样品的不同特点，因样品而异。

1.样品的污染

由于真空密封橡皮圈、真空泵倒流的微量油分子以及真空润滑油等化合物在镜筒内受电子束轰击时会分解而成一污染层，污染镜筒内各部件的表面（如光栏、样品杯、透镜内壁等），最麻烦的是污染样品，大大降低了分辨率。污染随时间和温度的增加而加重，在一般情况可达0.5～1Å/s。为此，电镜在样品周围设有防污染装置，用液态氮冷却的冷片凝结真空中的有机气体，从而降低样品的污染速度。

2.电子束辐射损伤

真空中残余的水蒸气分子在电子束作用下发生电离，形成的氢氧离子是有活性的，可冲击样品中的碳，形成一氧化碳而蒸发，这种作用可“烧去”样品，例如可使样品中的微孔扩大。电子束辐射还可使包埋树脂升华并使树脂颗粒结构增加，严重时可掩盖样品的细节，故操作时要尽可能减小电子束照射量（减低亮度、缩短观察时间）。

3.样品漂移

漂移指样品结构呈持续、缓慢和单方向的移动。光镜放大倍率低，样品极轻微的移动，对观察很少有影响。而电镜则要求十分苛刻，在高分辨率（例如3Å）操作时，在摄片曝光时间内要求样品漂移少于一个原子的直径。造成电镜样品漂移的因素有机械原因，如样品台运动不稳定等；有电子束照射引起的热漂移，如超薄切片吸收了能量而变热，引起切片极度扩张甚至撕裂；或者支持膜受热破裂所引起样品漂移。

（七）图像观察与记录

普通光学显微镜是通过单筒或双筒目镜观察样品的结构，记录方式都是采用顶置式照相机或CCD拍照。透射电子显微镜室通过观察室的荧光屏来观察样品的图像，采用平板底片机械照相系统或CCD采集图像，随着技术的发展，有的透射电子显微镜产品已经取消了机械照相系统，完全由CCD成像系统代替。从CCD接受信号探头与透射电子显微镜的结合方式可以把CCD分为底插式和侧插式，底插式视野小，分辨率高，适用于高分辨的材料科学研究；侧插式视野大，同等分辨率比底插式小，适合低倍数大视野的生物医学研究工作。

光镜常是观察研究后，摄片作为记录；而电镜则多重视于摄片后的研究。因为在荧光屏上长时间仔细观察会使样品在电子束作用下发生变化或样品受到污染，并且荧光屏乳胶颗粒粗，不如照片提供的细节多，故比较重视及时摄片，以便仔细研究。光镜由于受其分辨本领限制，摄片大多数不做进一步的光学放大，而电镜常需要做进一步光学放大（通常为2～3倍，一般不超过10倍），以便得到更多的信息。

（八）辐射损伤

普通光学显微镜在工作时，没有任何辐射；透射电子显微镜能够产生一定辐射射线，因为高速电子束流在运动过程中会撞击金属材料，就会激发出X射线等，但是剂量不大，生产商充分考虑从业人员的安全，在结构设计和保护上都采取了严格的措施。但操作人员在使用中要注意防护和定期做健康检查。特别是在操作过程中没有必要就不应退出聚光镜光栏，因退出后会产生过多的X射线。 9wjObTq9SlT4lUTZ3PVTpGOyRqnGKBGVVSJkxo4uTt78+nrUBVXWZofc2be6hN5a