第二章 电子显微镜的基本原理

人类认识自然界大部分信息来自眼睛，在对周围世界的认识中，总是希望看到细微的细节。众多微观世界的结构需要能够分辨，并达到人裸眼分辨的状态，才能够正常观察。由于正常人眼在25 cm明视状态下，能够分辨的距离是0.2 mm，因此可以使用放大镜将物体放大来观察物体的细节。例如，用10倍的放大镜可以将两个质点间的距离放大10倍，肉眼即可以分辨出0.02 mm之间的两点，使物体看得更清晰。但放大镜的倍数有限，不能达到更高的分辨率。因此，分辨本领和放大倍率成为电子显微镜要解决的两大基本问题。

一、分辨本领

（一）分辨本领

分辨本领或称分辨能力是电子显微镜最重要的参数之一，分辨能力的高低决定一台电镜的优劣。分辨本领以分清两个质点间的最短距离来表示。能被分辨的两个质点之间的距离越短，其分辨本领越高。

物体在眼视网膜上的成像与物体和眼之间的距离有关：物体与眼的距离缩小，视网膜上呈的物像增大，眼的分辨能力就提高。但由于眼的屈光能力的限制，因此物体移近眼睛的距离是有限度的。一般人眼正常的工作距离为25 cm，并称其为明视距离。人眼25 cm的明视距离下，能分辨出相距0.2 mm的两个质点，故人眼的分辨率为0.2 mm。

早在100多年前，德国著名理论光学家Ernst Abbe给出了分辨本领（d）的证明公式。决定仪器分辨本领的因素由下述公式表示：

式中，d为分辨本领；λ为照明光的波长；n为介质折射率；α为物镜的半镜口角；n sin α称为孔径数（NA）。

以光镜油浸物镜为例计算其分辨本领。

注：d严格讲叫作分辨距离，而分辨本领或分辨率应为分辨距离的倒数（1/d）。

图2-1为物镜的镜口角。

由于镜口角已达极限，又无更高折射的介质可寻，光学显微镜的光源为可见光，其波长为0.39～0.78μm，由于受到光波特性的限制，故在可见光的条件下（λ以0.5μm带入公式）光镜的分辨本领约为0.2μm，已达理论极限，即光镜只能观察到大于0.2μm的结构，而对于细胞内或细胞间的许多细微结构无法观察。

从式（1）可导出仪器理论分辨本领，d =1/2 λ，故欲提高仪器的分辨本领必须寻找波长更短的照明源。

De Broglie发现高速的电子流（束）具有光波的微粒性和波动性，且波长很短，为电子显微镜的诞生奠定了理论基础，从而出现了以电子束代替可见光的电子显微镜。

二、放大倍率

放大倍率也是显微镜性能的一种指标。电子显微镜不仅需要有最佳的分辨本领，还需要有合理的放大倍率。只有通过合理地放大，人眼才能依靠电子显微镜的最佳分辨本领区分精细的物体和结构。

放大镜是凸透镜，其形状为中间厚，边缘薄。光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，使光线向中间汇聚。折射、聚焦是放大镜的基本原理（图2-2）。当用放大镜观察物体时，眼睛在放大镜上面，物体放在放大镜下面。物体的光线穿过时，发生折射，使光线向中间汇聚，进入人眼。物体在人眼视网膜上所成像的大小与物体对眼所张的角（视角）成正比。视角愈大，像也愈大，愈能分辨物体的细节。

光学显微镜的物镜、目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。

仪器总放大倍率是仪器各透镜放大率的乘积，以光镜为例：

ML=Mo×Me （2）

式中，ML为总放大倍率；M o为物镜放大率；M e为目镜放大率。用油浸物镜时，光镜总放大倍率为：

ML=100×10=1 000

如果增大M o或透镜数目，总放大倍率ML尚可增大，结果像虽然增大，但却是模糊不清的。这种无意义的放大，称空放大，确切地说就是超过有效放大率的放大称为空放大。

有效放大率由式（3）得出：

分辨本领为2Å的电镜有效放大率：

即100万倍，比光镜大1 000倍。

综上所述，不难看出决定仪器性能的根本指标是其分辨本领，而有效放大率由分辨本领所决定，超过有效放大率的空放大是徒劳的，而低于有效放大率时则是没有充分发挥仪器的性能。

这里应该指出的是，电镜的分辨本领与我们在观察电镜图像或拍摄电镜照片时实际所能达到的分辨率是有区别的。仪器的分辨本领是在仪器最佳状态下，用特殊制备的检测标本，由最熟练的操作者，也就是在最理想的条件下得到的。在常规操作中分辨率要低得多，如观察生物超薄切片样品其分辨率一般不高于25Å，负染样品可达15Å。

三、电子枪的结构及电子束的特性

（一）电子枪

发射电子束的装置称电子枪，由阴极、栅极和阳极组成（图2-3）。

由图2-3可以看出，顶端是灯丝（阴极），通上电流可以产生电子。下端是中央有一小孔的金属板称阳极。在二极之间加以高电压，此电压称加速电压，一般为几十千伏。阴极上产生的电子在阳极的吸引下快速穿过小孔形成电子流（束），在阴极和阳极之间另有一中央带孔的控制极（栅极）。栅极电压比阴极稍低，其作用是把阴极产生的分散电子聚焦，形成电子枪交叉点；改变其负电位就可以控制通过阳极的电子数目，即改变电子束的强弱（电子束流的大小）。

（二）电子束的特性

电子束是真空中相对集中而高速运动的电子流。电子具有粒子性和波动性，与光波的性质类似。

1.波长短

根据De Broglie理论，粒子在高速运动时会发射出一定波长的电磁辐射，其波长可由式（5）表示：

式中，λ为波长；h为普朗克常数，为6.626×10 ^-34 ；m为粒子质量；v运动为粒子运动速度，粒子运动的速度越快，发射的电磁波长越短。

在电场中高速运动的电子，根据能量守恒定律可得式（6）：

式中，e为电子的电荷量；V为加速电压。

从式（6）中得出，电子运动的速度与加速电压成正比。

电子的质量m =9.11×10 ^-31 kg，电子的电荷量e =1.602×10 ^-19 。由式（2）和式（3）推导出，电子束波长与加速电压的关系为：

表2-1为加速电压的波长关系。

可见，电子束的波长甚短，其波长随加速电压而变。即加速电压越高，波长越短；波长越短，分辨率越高。故欲求高分辨率，必须在高的加速电压条件下才能获得。一般电镜加速电压可以分为数挡，操作者可自行选择。

2.可折射性

电子束通过轴对称的电场或磁场时可改变其前进方向进行汇聚，相当于可见光通过玻璃透镜折射聚焦。磁场（电场）实际上是通以直流电的线圈（电极），称电子透镜。通过线圈的电流越大，磁场强度越强，电子透镜焦距越短，放大倍数越大，故电子透镜和玻璃透镜不同，其焦距是可变的。

3.穿透能力弱

电子束穿透能力甚弱，在空气中只能运行几毫米，不能穿过玻璃。故电镜必须是高真空，切片必须超薄（小于0.1μm），并要用铜网和有机支持膜来代替玻璃载玻片。

4.成像直接不可见

电子束穿过样品，通过电子透镜聚焦所成的放大图像，人眼直接不可见，只有通过样品的电子束打在荧光物质上产生较长的光波才能呈现可见的图像，电子束可使照相底片乳胶感光，故图像可记录于照像底板上。

5.能激发金属产生X射线

高能电子束能够激发金属产生X射线，对人体造成较大伤害。因此，电镜应具备相应的防护——铅防护，电镜工作人员要注意加强自我防护。

四、反差

反差又称对比度，指图像中各部分细节的亮度与它们的背景亮度的差别。如果反差太弱，即使仪器分辨本领很高，也不能辨认样品的细节。光镜中图像反差主要靠样品中不同部分的细节对光的吸收差别而形成。样品对光吸收少的地方，图案就亮；样品对光吸收多的地方，图案就暗。透射电镜的样品极薄，故吸收不是主要的。其反差主要由样品内各种结构对入射电子的散射程度不同而引起。当入射电子作用于样品时，部分电子将会与样品中的原子核和周围的电子相碰撞使其运行轨道偏离初始方向，这种现象称之为散射，这部分电子称为散射电子，而直接穿过样品的电子称为透过电子。因物镜光栏接地，散射角大的电子被光栏挡住除去，只让散射角小的电子和透射电子通过光栏孔参与成像（图2-4）。

样品对入射电子的散射能力大小与样品的质量厚度有关。所谓样品的质量厚度是指样品厚度与样品密度的乘积。样品厚度即样品厚薄程度，样品越厚，入射电子在样品中经历的时间、空间越长，受样品作用的机会越多，被散射的程度越大。样品密度即样品中所含元素的原子序数的大小及原子数目的多少。样品的原子序数越大，密度就越大，样品散射电子的能力就越强。由此可见透射电镜反差的形成是由于样品中各部分质量厚度不同，对入射电子散射的能力不同，参与成像的透射电子的数目多少不同，故荧光屏上的亮暗程度不同所致。电子的散射程度又称为电子密度。所谓高电子密度或电子致密就意味是散射电子多，透过电子少，形成荧屏图象中暗的部位。反之样品中透过电子较多的地方，因散射电子较少，而显得亮些，这样的亮区又常用电子透明这一术语来描述。

生物样品主要由C，H，O，N等轻元素组成，这些轻元素对电子散射极弱且差别不大，故反差极小，因而不经处理的生物样品在透射电镜下几乎无法辨认。目前，应用重原子与样品中某些结构和成分选择性地结合，目的就是在于增加样品的质量厚度，从而增强样品的反差。对样品的这种处理，称电子染色。

五、场深（景深）与焦深

物体置于透镜的前方，于透镜后方置一屏幕，物体聚焦在屏幕上呈清楚的像。如果把物体在光轴方向前后移动一定距离，而屏幕上的像仍是清楚，这段距离就是场深（景深），因此，场深也可理解为成像清楚地观察对象的厚度。反过来物体不动，在光轴方向前后移动屏幕一定距离，而像始终清楚，这段可移动的距离称之为焦深。光镜的场深、焦深甚短，放大倍率100倍时，场深0.2μm左右，比光镜样品厚度（7μm）小得多，因此在聚焦成像时既不会出现结构重叠，同时通过不同平面的聚焦可得到样品中更多的信息，有可能重建某些微细结构的三维立体形态。电镜的场深和焦深比光镜长得多。

电镜场深由式（8）可得：

式中，P为场深，d为分辨本领，α为1/2物镜孔径角。电镜物镜孔径角甚小，α约为10-3rad。

电镜焦深由式（9）可得：

式中，L为焦深；M为系统放大倍率。

如分辨本领为10Å的电镜，其场深是1μm。由于场深大大超过电镜样品的厚度（通常为600～700Å），故整个样品的全部细节即使在与光轴倾斜了一个很大角度的情况下均能同时聚焦成像，这有利于电镜的聚焦。如系统放大倍率为10 ⁴ ，其焦深可达100 m，因此，电镜中照相底片可以放在荧光屏的下方，也可以放在荧光屏的上面，而不影响成像的清晰度。

六、像差

像差即由透镜所引起的像的失真。电镜有与光镜类似的各种像差，但光镜的各种像差通过用多种曲度和折射率不同的透镜组成的组合透镜得以克服。而电镜则不行，减小物镜孔径角是减少其大多数像差较为有效的方法，然而这意味着要降低分辨本领，对分辨率为2～3Å的电镜来说，物镜最佳孔径角为10 ^-3 ～10 ^-2 rad。因此，可以说光镜的分辨本领受光波的波长限制，而电镜分辨本领受到的限制，主要是像差问题尚未得到满意解决。如电镜加速电压为100kV时，其分辨本领的理论极限d =1/2 λ =1/2×0.037≈0.02Å，但目前实际仅达2Å，还相差100倍。

（一）球差

球差就是从一点出发的射线通过透镜后不能都汇聚在一点上，而是近轴的射线比通过透镜边缘的射线汇聚得远一些（图2-5）。因此，在像平面上所成的像不是清晰的一点而是呈模糊的圆斑。此圆斑的直径dS即为球差，可用下式表示：

dS =1/2 CS·α ³ （10）

式中，CS为球差系数；α为物镜孔径角。可见减小孔径角，可减小球差，但分辨本领也随之下降。从衍射角度来看，孔径角越小，衍射的影响越大。因此，综合考虑效果，一般选用最佳孔径角10 ^-3 ～10 ^-2 rad。

（二）色差

不同波长的射线通过透镜时，将在不同的距离上聚焦，因而物点所成的像是一个模糊的圆斑，这种现象称为色差（图2-6）。与光学透镜相比，电磁透镜还增加了旋转色差，即当物体上所有各点的旋转角度都相同时，所有像点的旋转角度往往并不相同。电镜为防止色差，要尽量保持稳定的加速电压和稳定的透镜电流，前者为保持电子束的波长恒定，后者为保持透镜焦距的恒定即放大倍率的稳定。对一台分辨本领为5Å的电镜，要求在5 s之内加速电压的波动不得超过5万分之一，而电流稳定度要求在十万分之一数量级。

（三）像散

像散是由于透镜磁场的轴不是对称的，因而在两个垂直方向上具有不同的焦距所引起的。样品的南北成像平面与东西成像平面不在同一平面上，从而形成像散（图2-7（a））。

在设计安装电镜时磁透镜应该是严格轴对称的，但事实上由于材料的不均匀性和机械加工及装配的误差，总会存在一定像散，这种仪器本身的像散叫固有像散，像散可以利用一个磁场方向和强度可以改变的消像散器加以纠正，使其减至最小，在电镜使用过程中，需要经常调解消像散器。

（四）像的畸变

像的畸变为球差引起的另一种缺陷，是物镜所成的像再通过投影镜放大时，边缘部分的聚焦能力强，焦距短；近轴部分的聚焦能力弱，焦距长，因而像的放大倍数随着离轴的远近而改变，从而使图像发生弯曲（图2-8）。可以看出，它不是一种散焦效应，而标志着像与物几何相似性的破坏。假如原物是一个正方形，例如铜网格，由于畸变，放大以后每边可能向内弯曲成枕形或向外弯曲成桶形，还可发生扭曲而成S形。像的畸变在低倍放大时更为严重。设计时，可以使中间镜和投影镜的畸变互相补偿，把畸变减少到可以忽略不计的程度。