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溶血性贫血(hemolytic anemia, HA )是指由于某种原因红细胞病理性破坏增加，寿命缩短，骨髓代偿能力不能补偿所引起的一类贫血。此时骨髓对贫血的刺激有强大的代偿功能，可增加到正常的6～8倍，故本病是以红细胞的破坏和活跃的红细胞生成同时并存为特征的一组疾病。按溶血的场所分为红细胞主要在血液循环中破坏的血管内溶血和主要在组织巨噬细胞质中被破环的血管外溶血;根据病因和发病机制将溶血性贫血分为遗传性和获得性两大类。遗传性溶血性贫血多由红细胞内在的缺陷(包括膜、酶、血红蛋白合成异常)所致， 但G6PD缺乏症当外因不存在时不发病;获得性溶血性贫血多由红细胞外在缺陷(包括免疫因素、药物因素、生物因素、物理因素等)所致，但阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH )例外，它是获得性的以红细胞内在缺陷为特征的溶血性疾病。由于溶血性贫血是非常复杂的一类综合征，其病种繁多，发病机制和病因各异，对其进行诊断和鉴别诊断都较困难。一定要明确溶血的病种，通过实验室的检查可对不同的溶血性贫血进行诊断和鉴别诊断。免疫相关溶血性贫血(immune hemolytic anemia)的内容见第十七章。
实验室分析路径见图1-5、图1-6。
溶血性贫血的血液学特征表现为骨髓造血活动的增强以及红细胞破坏的增加，诊断溶血性贫血的病因时应将全血细胞计数和后续的病因诊断实验结果进行分析，尤其是红细胞形态学检查，对溶血性贫血的鉴别诊断具有重要的意义。溶血相关实验主要分为显示溶血的检测、检测红细胞膜、红细胞酶、血红蛋白异常的相关病因诊断实验等。
图1-5 溶血性贫血的实验室诊断路径图
1. 血浆游离血红蛋白检测
利用血红蛋白具有类过氧化物酶活性的特点，采用过氧化物酶法检测血浆游离血红蛋白(plasma free hemoglobin)。血红蛋白可催化H 2 O 2 释放新生态氧，使联苯氧化为蓝紫色。根据显色深浅，与同时测定标准血红蛋白液对照，可测出血浆游离血红蛋白的量。正常参考范围为0～40mg/L。正常情况下，血浆中血红蛋白大部分与结合珠蛋白结合，仅有微量游离血红蛋白。红细胞破坏增加时血浆游离血红蛋白明显增高。
2. 血清结合珠蛋白
血清结合珠蛋白(haptoglobin, Hp )可与血浆中游离的Hb结合形成复合物，此复合物在单核-吞噬细胞系统和肝内被消除。溶血时血浆中的游离血红蛋白与Hp结合增多，使血清中结合珠蛋白减少，测定血清中结合珠蛋白的含量可反映溶血的情况。通过电泳法测定Hp-Hb复合物的量或依据Hp-高铁血红蛋白复合物具有过氧化酶活性可催化过氧化氢氧化疮木酚生成有色的氧化疮木酚的特点比色测定复合物酶活性，检测血清中结合珠蛋白的含量。正常参考范围为0.5～1.5g/L。
3. 血浆高铁血红素白蛋白检测
血浆中游离的血红蛋白可被氧化为高铁血红蛋白，再分解为珠蛋白和高铁血红素，后者先与血中的血红蛋白结合，血红蛋白消耗完后，高铁血红素与白蛋白结合形成高铁血红素白蛋白(methemalbumin) ，后者与硫化铵形成一个易识别的铵血色原，用光谱仪观察结果，于558nm处有一最佳吸收区带。正常人呈阴性，血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白。
4. 尿含铁血黄素实验
又称Rous实验，当血红蛋白通过肾滤过时，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿液排出。尿中含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，其中的高铁离子与亚铁氰化钾作用，在酸性环境下产生普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀。尿沉渣肾小管细胞内可见直径1～3μm的蓝色颗粒。正常人为阴性。慢性血管内溶血时本实验为阳性。
图1-6 遗传性溶血性贫血的实验室诊断路径图
G6PD:红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶; PK:红细胞丙酮酸激酶
1. 红渗透脆性实验及渗透脆性孵育实验
本实验检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力。根据不同浓度的低渗盐溶液中红细胞溶血的情况反映红细胞其表面积与容积的比值，反映对低渗盐溶液的抵抗性。比值愈小，红细胞抵抗力愈小，渗透脆性增加;反之抵抗力增大，渗透脆性减低。而经24小时37℃孵育消耗红细胞的ATP和能量，再观察红细胞在不同浓度的低渗盐溶液中溶血情况。一般检测应用简易半定量法，正常情况开始溶血: 3.8～4.6g/L NaCl溶液;完全溶血: 2.8～3.2g/L NaCl溶液。遗传性球形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症和部分自身免疫性溶血性贫血时渗透脆性增加，地中海贫血、血红蛋白C、D、E 病，低色素性贫血、阻塞性黄疸、脾切除术后等渗透脆性减低。
2. 红细胞膜三磷腺苷活性测定
Na + -K + -ATP酶、Ca 2+ -Mg 2+ -ATP酶和Mg 2+ -ATP酶都是红细胞膜上的ATP酶。为测定酶活性可分别测定酶作用于ATP的水解产物(无机磷)含量，若在基质中只加入Ca 2+ 、Mg 2+ 、ATP 可测定Ca 2+ -Mg 2+ -ATP酶的活性，若在基质中加入Na + 、K + 、Mg 2+ 和ATP，测定的为Na + -K + -ATP酶和Mg 2+ -ATP酶的共同含量，再在基质中加入Na + -K + -ATP酶的抑制剂，测定结果仅为Mg 2+ -ATP酶活性，两者差为Na + -K + -ATP酶活性。参考范围为:红细胞膜Na + -K + -ATP酶:( 2.93±0.67) mU/10 9 红细胞; Ca 2+ -Mg 2+ -ATP酶: 0.4～2.5μmol/ L•mg膜蛋白 -1 •h -1 遗传性球形红细胞增多症时红细胞膜Na + -K + -ATP酶活性增加, Ca 2+ -Mg 2+ -ATP酶活性减低。蚕豆病时红细胞膜Ca 2+ -Mg 2+ -ATP酶活性减低。
3. 酸化甘油溶血实验
当甘油存在于低渗溶液氯化钠磷酸缓冲液时，可阻止低渗溶液中的水快速进入红细胞内，减慢溶血过程。但甘油与膜脂质又有亲和性，可使膜脂质减少。当红细胞膜蛋白及膜脂质有缺陷时，它们在pH 6.85的甘油缓冲液中比正常红细胞溶解速度快，导致红细胞悬液的吸光度降至50%的时间(AGLT 50 )明显缩短。正常人AGLT 50 >290秒，遗传性球形红细胞增多症AGLT 50 明显缩短( 25～15秒)。自身免疫性溶血性贫血、肾衰竭、妊娠等AGLT 50 也可缩短。
4. 红细胞膜蛋白电泳分析
将制备的红细胞膜样品进行SDS-PAGE电泳，根据样品中各蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而可见各膜蛋白组分百分率。红细胞各种膜蛋白组分百分率变化较大，多与正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较。许多溶血性疾病常见红细胞膜蛋白异常。各种膜缺陷疾病如遗传球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常。某些血红蛋白病骨架蛋白等可明显异常。但红细胞膜蛋白电泳一般实验室未开展。
1. 高铁血红蛋白还原实验
在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红蛋白转变成高铁血红蛋白，正常红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose 6 phosphate dehydrogenase, G6PD )催化戊糖旁路使NADP (辅酶Ⅱ氧化型)变成NADPH (辅酶Ⅱ还原型) ，脱的氢通过加入亚甲蓝的递氢作用而使高铁血红蛋白(Fe 3+ )又还原成亚铁血红蛋白(Fe 2+ )。当G6PD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降，甚至不还原。通过比色测定高铁血红蛋白，可观察还原的多少和还原的速度，从而间接反映了G6PD的活性。正常人(G6PD活性正常) :外周血高铁血红蛋白还原率大于或等于75%;脐血大于或等于77%。G6PD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。蚕豆病和伯氨喹型药物溶血性贫血等患者，均可出现下降的结果。G6PD中间缺乏值(杂合子)还原率为31%～74%，脐血为41%～76%; G6PD严重缺乏值(纯合子)还原率小于或等于30%，脐血小于40%。其简便易行，可作为G6PD缺乏的过筛实验。
2. 变性珠蛋白小体生成实验
可作为G6PD缺乏的筛检实验, G6PD缺乏的患者血样加入乙酰苯肼于37℃孵育2～4小时，乙酰苯肼可使血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，高铁血红蛋白解离成高铁血红素和变性珠蛋白，变性珠蛋白聚合成变性珠蛋白小体，附于红细胞膜上。用煌焦油蓝染色观察红细胞中含变性珠蛋白小体的情况。正常人含5个及5个以上珠蛋白小体的红细胞一般<<span class="zhangyue-western">30%。阳性细胞百分率大于30%有临床意义。G6PD缺乏症常高于45%，但含有不稳性血红蛋白的患者阳性细胞也大于30%，还原型谷胱甘肽缺乏症也增高。
3. 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定
红细胞中的G6PD可催化葡萄糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡萄糖酸，同时使反应体系中的NADP + 还原成NADPH, NADPH在340nm波长处有吸收峰，直接测定340nm波长处吸光度的变化，通过计算单位时间生成的NADPH的量来测定G6PD活性。正常人G6PD酶活性为( 12.1±2.09) U/gHb (Zinkham法)。G6PD缺陷见于蚕豆病、服用某些药物(如伯氨喹、磺胺药、抗疟药、砜类药)后药物性溶血性贫血、感染等。利用此试验可对高发区域人群或疑诊的新生儿进行筛查。
4. 丙酮酸激酶活性测定
在二磷酸腺苷(ADP)存在的条件下，丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化成丙酮酸，后者在乳酸脱氢酶(LD )催化下转化为乳酸，同时使反应体系中还原型辅酶Ⅰ(NADH)氧化成NAD + ，因NADH在340nm波长处有吸收峰，而NAD + 没有，可通过测定340nm波长下吸光度的下降，计算单位时间NADH减少量来求得PK活性。正常人PK酶活性为( 15.0±1.99) U/g Hb。红细胞PK活性测定是诊断丙酮酸激酶缺乏症直接和可靠的证据，先天性丙酮酸激酶缺乏PK活性减低或消失，纯合子患者PK值在正常活性的25%以下，杂合子患者为正常的25%～50%。继发性丙酮酸激酶缺陷如白血病、再生障碍性贫血、MDS等, PK活性也可减低。
1. 血红蛋白电泳
血红蛋白电泳(hemoglobin electrophoresis)的目的是检出和确认各种正常和异常的血红蛋白。根据不同的血红蛋白带有不同的电荷，等电点不同，在一定的pH缓冲液中，血红蛋白的等电点小于缓冲液的pH时带负电荷，电泳时在电场中向阳极泳动，反之，血红蛋白带正电荷向阴极泳动。在一定电压下经过一定时间的电泳，不同的血红蛋白所带电荷不同、分子量不同，其泳动方向和速度不同，可分离出各自的区带，同时对电泳出的各区带进行比色或电泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。一般最常用的是pH 8.6的碱性血红蛋白电泳, pH 8.6 TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳时正常血红蛋白电泳区带: HbA>95%、HbF<<span class="zhangyue-western">2%、HbA 2 为1.0%～3.1%。pH 8.6 TEB缓冲液适合于检出HbA、HbA 2 、HbS、HbC，但HbF不易与HbA分开, HbH与Hb Barts不能分开和显示。pH 6.5 TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳主要用于HbH和Hb Barts的检出。血红蛋白电泳为定性试验，可以检测各种正常和异常血红蛋白的存在和相对的含量。大约只有1/3的异常血红蛋白可用pH 8.6醋酸纤维薄膜电泳分离检出，其余许多异常血红蛋白在常规电泳中不能与HbA分离，故pH 8.6醋酸纤维薄膜电泳未分离出异常血红蛋白区带不能完全排除异常血红蛋白的存在，应用等电聚焦电泳、高效液相色谱等技术可提高检出率。
2. 抗碱血红蛋白检测
胎儿血红蛋白(HbF )及某些异常血红蛋白具有比HbA更强的抗碱作用，将待检的溶血液与一定量的NaOH溶液混合，作用1分钟后加入半饱和硫酸铵终止碱变性反应。HbF抗碱变性作用强，没有变性存在于上清液中，而HbA变性沉淀，取上清液于540nm处测定吸光度，检测出HbF的浓度。此实验也称为碱变性实验，其检测的是抗碱血红蛋白，除HbF外, Hb Barts和部分HbH也具有抗碱能力，需通过电泳鉴别。成人<<span class="zhangyue-western">2%,新生儿<<span class="zhangyue-western">40%。珠蛋白生成性贫血时HbF增加，重型者达30%～90%，中间型常为5%～30%，轻型小于5%。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征患者, HbF可高达100%。HbF相对增多可见于骨髓纤维化、白血病、浆细胞瘤等恶性疾病及再生障碍性贫血、PNH、卟啉病等。HbF生理性增多，见于孕妇及新生儿。
3. 红细胞包涵体实验
不稳定血红蛋白容易氧化变性沉淀。红细胞包涵体实验(heinzbody forming test)是将氧化还原染料——煌焦油蓝染液与新鲜血液一起孵育，不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体。血红蛋白包涵体为深蓝色小颗粒，正常人为阴性结果。HbH病时孵育1小时就可出现包涵体，也叫HbH包涵体。孵育3小时不稳定血红蛋白病多数红细胞内可出现变性珠蛋白肽链沉淀形成的包涵体。不同型的不稳定血红蛋白所需温育时间和形成包涵体的大小、形态、数量、分布可有不同。G6PD缺乏或红细胞还原酶缺乏及化学物质中毒等红细胞中也可出现包涵体。本实验是不稳定血红蛋白特别是HbH诊断的过筛实验。
4. 异丙醇沉淀实验
因不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易解裂，在异丙醇这种能减低血红蛋白分子内部的氢键的非极性溶剂中，不稳定血红蛋白的稳定性下降，比正常血红蛋白更快地沉淀。当溶血液中含有不稳定血红蛋白时，溶血液在加入异丙醇后很快混浊，并形成绒毛状沉淀。正常人脐血为阳性结果，新生儿出生1个月后逐渐开始转为阴性, 6个月后血红蛋白液为阴性。不稳定血红蛋白病的患者实验常于5分钟时出现混浊, 20分钟开始出现绒毛状沉淀。在HbF、HbH、HbE含量大于4%、G6PD缺乏、α地中海贫血时均可出现阳性结果。实验结果阳性只能说明存在不稳定血红蛋白。本实验易出现假阳性，特异性较差，是不稳定血红蛋白的过筛实验。
5. 热变性实验
也称为热不稳定实验(heat instability test) ，其根据不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性的特点，观察血红蛋白液在50℃时是否出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检。正常人热沉淀血红蛋白多小于1%，热沉淀血红蛋白超过5%提示不稳定血红蛋白存在。HbF、HbH、HbE含量增高时，及G6PD缺陷和α地中海贫血时结果均偏高。
6. 血红蛋白分子生物学技术检测
应用基因探针、DNA微阵列、限制性内切酶图谱分析、聚合酶链反应(PCR )、扩增不应突变系统技术、多重突变引物延伸扩增技术、反向斑点杂交、特异性寡核苷酸杂交等一系列分子生物学技术，可检测出异常血红蛋白基因的存在，明确基因型及基因的缺陷部位等。通过血红蛋白异常基因的检测，可在分子水平上进行血红蛋白病的诊断和研究，具有重要的临床诊断价值。
1. 酸化血清溶血实验
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH )患者体内存在对补体敏感的红细胞。酸化血清溶血实验(acidified-serum hemolysis test ) ，也称微量Ham test，将红细胞在酸性(pH 6.4～6.5)的正常血清中孵育，补体被激活, PNH红细胞破坏，产生溶血。而正常红细胞不被溶解，无溶血现象出现。正常人为阴性，本实验阳性主要见于PNH，某些自身免疫性溶血性贫血发作严重时可呈阳性。该检测可协助PNH的诊断，是PNH确诊最基本的实验。
2. 蔗糖溶血实验(sucrose hemolysis test)
用于检测PNH患者的红细胞缺陷。患者的红细胞在低离子强度的蔗糖溶液中对补体敏感性增强，经孵育，补体与红细胞膜结合加强，使补体敏感红细胞的膜造成缺损，结果导致蔗糖溶液通过缺损处进入红细胞内，引起渗透性溶血。而正常人红细胞则不发生溶血。定性试验正常为阴性;定量试验正常溶血率<<span class="zhangyue-western">5%。蔗糖实验可用于一切诊断不明的溶血性贫血与骨髓再生不良的患者, PNH患者常呈阳性, AA-PNH综合征患者亦可阳性。部分自身免疫性溶血性贫血、巨幼细胞贫血、遗传性球形红细胞增多症患者可呈弱阳性。
3. CD55、CD59检测
阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH )的发病机制是血液细胞膜表面糖化磷脂酰丝氨酸锚蛋白的缺失，可通过检测CD55 (退变加速因子)和CD59 (反应性溶血膜抑制物)这两种常见的血细胞表面锚蛋白相关抗原的表达情况，辅助诊断PNH。检测方法是根据免疫学原理，用CD55或CD59荧光标记的单克隆抗体，通过流式细胞仪检测红细胞和(或)粒细胞CD55阴性和CD59阴性细胞数，计算其百分率。正常人红细胞CD55、CD59及粒细胞CD55、CD59表现为单一阳性峰，低表达群应小于3%。若在检测标本中发现有CD55或CD59低表达群的增多，支持PNH诊断。本实验是诊断PNH特异性高、敏感性强且可定量的检测方法。
4. 蛇毒因子溶血实验(venom hemolysis test)
多采用从眼镜蛇毒中提取的一种蛇毒因子(C3b) ，可通过旁路途径激活补体, PNH患者的红细胞补体系统激活后，促使PNH补体敏感红细胞破坏、溶血。正常人溶血率<<span class="zhangyue-western">5%,溶血率增加大于10%显示患者有PNH的可能。PNHⅢ型红细胞对蛇毒溶血实验敏感性最高，正常红细胞、PNHⅠ型和PNHⅡ型等的红细胞均不发生溶血。本实验临床上用于检测PNH，溶血度越高，说明PNHⅢ型红细胞所占比例越多。
确定溶血性贫血存在的检验:依据病史，有贫血、黄疸，网织红细胞计数增加，考虑为溶血性贫血的可能。溶血性贫血的诊断主要应寻找的证据有:①红细胞寿命缩短或破坏过多:红细胞寿命测定明显缩短，血红蛋白浓度减低，异形红细胞较多出现，血中游离血红蛋白浓度增加，血清非结合胆红素增加，尿胆原阳性，尿含铁血黄素实验阳性，血清乳酸脱氢酶活性增加等;②骨髓红细胞系统代偿性增生:网织红细胞明显增多，骨髓红系增生明显活跃，粒红比例缩小或倒置。
确定溶血病因明确诊断的检验:依据病史找线索，并结合其临床资料有的放矢地选择筛选实验和确诊实验，对不同类型的溶血性贫血进行确诊。如遗传性溶血性贫血选择红细胞脆性实验，自身溶血实验，红细胞酶缺陷的检出，血红蛋白电泳，异常血红蛋白的检测等;获得性溶血性贫血选择抗人球蛋白实验，冷凝集素实验，冷热溶血素实验，血清蛋白电泳等;药物所致溶血性贫血选择高铁血红蛋白检测, G6PD筛选实验，包涵体实验和药物依赖性抗体检测等;机械性损伤所致溶血性贫血在血片可检出异常形态红细胞和各种红细胞碎片。
1. 红细胞膜缺陷溶血性贫血的检查
遗传性球形红细胞增多症血红蛋白和红细胞量正常或轻度减低，白细胞和血小板正常。血片中红细胞呈球形，大小比较均一，染色后细胞中央淡染区消失。网织红细胞增加。血涂片和阳性家族史有决定性诊断价值。红细胞渗透脆性增高，常于5.2～7.2g/L的低渗盐水开始溶解, 4.0g/L完全溶解，孵育后脆性更高，加葡萄糖或ATP能够纠正。80%的患者红细胞膜电泳分析(SDS-PAGE电泳)可发现异常。目前应用分子生物学技术如用单链构象多态性分析(SSCP)、聚合酶链反应(PCR)结合核苷酸测序等可检出膜蛋白基因的突变位点。
遗传性椭圆形红细胞增多症有轻重不等的贫血。血片中椭圆形红细胞的比例大于25%。其形呈椭圆形、卵圆形、棒状或腊肠形，红细胞横径与纵径之比小于0.78，硬度增加，中心淡染区消失。骨髓红细胞系统增生活跃为增生性贫血骨髓象。红细胞渗透脆性实验和自身溶血实验多增高。红细胞膜蛋白电泳分析及低离子强度非变性凝胶电泳膜收缩蛋白分析出现异常结果有助于膜分子病变的确定。
2. 红细胞酶缺陷性溶血性贫血的检查
红细胞G6PD缺陷症除遗传性非球形细胞溶血性贫血外，患者平时无明显异常改变，在诱因的作用下出现急性溶血时，有血管内溶血共同的实验室检测特征，而遗传性非球形细胞溶血性贫血具有慢性血管外溶血的实验室特征，红细胞形态一般无明显异常，可有少数异形或破碎的红细胞。G6PD缺乏的筛检实验(高铁血红蛋白还原实验、G6PD荧光斑点实验、硝基四氮唑蓝试纸片法)均为阳性结果，在筛检实验中以荧光斑点实验的特异性最高，高铁血红蛋白还原实验的敏感性最强，但均不能准确检出红细胞G6PD缺乏的杂合子。G6PD活性定量检测能准确反映酶的活性，为G6PD缺陷症的确诊实验。通过同时测定G6PD和6PGD活性并计算G6PD/6PGD比值，可提高杂合子的检出率。
红细胞丙酮酸激酶缺陷症时红细胞自溶血实验阳性，加ATP可完全纠正，加葡萄糖不能纠正。PK荧光斑点实验中等缺乏者(杂合子型) 25～60分钟荧光消失，严重缺乏者(纯合子型) 60分钟荧光仍不消失。酶活性定量检测，中等缺乏者(杂合子型)为正常活性的25%～35%，严重缺乏者(纯合子型)为正常活性的25%以下。中间代谢产物测定可见2, 3-二磷酸甘油酸( 2, 3-DPG )、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、2-磷酸甘油酸( 2-PG )在PK缺乏时较正常增加2个标准差以上。
3. 地中海贫血的检查
一般溶血的检查表现为贫血轻重不等，红细胞大小不均，靶形红细胞和异形红细胞增多，多大于10%。进行溶血相关检测，红细胞脆性减低。地中海贫血多为小细胞性贫血，需与缺铁性贫血鉴别。
( 1) 血红蛋白电泳:
电泳技术无论是对珠蛋白肽链的结构异常还是肽链合成量的异常的诊断均有重要意义，选择适当的血红蛋白电泳可检测出各类异常血红蛋白及各血红蛋白成分的相对含量。地中海贫血时，可通过血红蛋白电泳进行实验室诊断，β地中海贫血患者HbF增加及HbA 2 增加，α地中海贫血患者HbH或Hb Barts增加。各类地中海贫血电泳结果见表1-9。
表1-9 各型地中海贫血的血红蛋白电泳结果
( 2) 基因诊断:
地中海贫血均有基因突变，体外珠蛋白比率分析、基因探针及限制性内切酶图谱法、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、特异性寡核苷酸杂交法等检测进行基因分析可用于疾病的诊断和分型及骨髓移植和基因治疗的研究。通过对外周血或脐血进行基因诊断，可确定是否患病及具体的分子缺陷类型。通过对绒毛细胞或羊水细胞进行DNA诊断，对胚胎脐血进行基因诊断可进行产前诊断以防止纯合子患儿的出生。α地中海贫血主要是α珠蛋白基因缺失或突变所致。通过Southern印迹杂交分析和PCR方法检测其基因缺失。β地中海贫血主要为点突变型，是一组高度异质性的遗传性疾病，应用寡核苷酸探针杂交技术和PCR-限制性内切酶酶解法可检测出已知的β地中海贫血基因的突变。
4. 异常血红蛋白病的检查
镰状细胞贫血(HbS病) :血红蛋白减低(一般为50～100g/L )。红细胞大小不均，可有小细胞、大细胞、异形细胞、多染性红细胞、有核红细胞、靶形红细胞等，镰状红细胞不多见。网织红细胞增加(常大于10%)。红细胞镰变实验阳性，红细胞渗透脆性明显下降。血红蛋白电泳可见HbS带位于HbA和HbA 2 间，结果显示HbS占80%以上, HbF增至2%～15%, HbA 2 正常, HbA缺乏。
血红蛋白E病:多为小细胞低色素性轻度贫血。红细胞渗透脆性减低。血红蛋白电泳显示HbE占75%～92%, HbE的电泳特征为在pH 8.6或8.8时, HbE移动速度较HbC稍快， 与HbA 2 完全相同，不能分开; pH 6.8酸性凝胶电泳可与HbC和HbA 2 区分。因HbE不稳定，异丙醇沉淀实验阳性和热变性实验弱阳性;变性珠蛋白小体检测阳性。
不稳定血红蛋白病:变性珠蛋白小体检查出现阳性结果对疾病诊断有重要意义、热变性实验和异丙醇沉淀实验为阳性，一般用异丙醇实验筛选，再做热变性实验和变性珠蛋白小体检查进行诊断。血红蛋白电泳仅有部分病例可分离出异常血红蛋白区带。通过分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶电泳不稳定血红蛋白和潜在异常血红蛋白可清晰分离。
5. 阵发性睡眠性血红蛋白尿症的检查
贫血为几乎所有患者的表现，血细胞分析呈正色素性或低色素性贫血(尿中铁丢失过多时) ，网织红细胞增高，可见有核红细胞及红细胞破片。白细胞和血小板多减少，半数患者为全血细胞减少。
( 1) 骨髓象分析:
半数以上的患者三系增生活跃，尤以红系造血旺盛。随病情变化表现不一，不同穿刺部位增生程度可明显差异，故增生低下者应注意穿刺部位，必要时作病理活检。
( 2) 特殊溶血实验:
尿含铁血黄素实验阳性为溶血存在的依据;热溶血实验、蔗糖溶血实验、酸化血清溶血实验阳性是补体敏感的红细胞存在的依据，蔗糖溶血实验是PNH的筛选实验，敏感但特异性较差。酸化血清溶血实验特异性高，多数患者为阳性，其是诊断的重要依据。
( 3) 流式细胞术检测:
发现GPI锚连接蛋白(CD55或CD59)低表达的异常细胞群，支持PNH诊断。本实验是目前诊断PNH特异性和敏感性最高且可定量的检测方法。
1. 遗传性球形红细胞增多症
无特异的临床表现和实验室检查，诊断时应结合病史、临床表现和实验室检查综合分析。血涂片中小球形细胞大于10%，红细胞渗透脆性增加，有阳性的家族史，本病的诊断可成立。应注意与自身免疫性溶血性贫血所致继发性球形细胞增多相鉴别，可做红细胞膜蛋白分析和组分定量，必要时采用基因序列分析的方法，寻找诊断依据和进行家系调查以鉴别诊断。
2. 红细胞G6PD缺陷症
诊断依靠实验室检测红细胞G6PD活性的证据，临床表现及阳性家族史对诊断也非常重要。筛选实验中两项中度异常;或一项筛选实验中度异常加上Heinz小体生成实验阳性(有40%红细胞含Heinz小体，每个红细胞有5个以上Heinz小体)并排除其他溶血病因;或一项筛选实验中度异常，伴有明确的家族史;或一项筛检实验严重异常;或定量测定G6PD活性较正常平均值减低40%以上，均可确诊。并据不同发病情况对其进行临床分型。
3. 红细胞PK缺乏(引自《红细胞疾病基础与临床》)
①PK荧光斑点实验结果为PK活性缺乏;②PK活性定量测定为纯合子范围;③PK活性定量测定为杂合子范围，伴有明显家族史和2, 3-DPG两倍以上增高或中间代谢产物改变。符合以上三项中任何一项，支持PK缺乏的实验室诊断。遗传性红细胞PK缺乏症的诊断主要通过红细胞PK活性的测定进行诊断。在诊断时应注意与继发性PK缺乏进行鉴别并应考虑变异型的实验室诊断。
4. 地中海贫血
地中海贫血(thalassemia )是由于基因缺陷导致血红蛋白中至少一种珠蛋白合成缺乏或不足，引起的贫血或病理状态，是一组常染色体不完全显性遗传性疾病。根据缺乏的珠蛋白链的种类及缺乏程度给予命名和分类，地中海贫血可分为α地中海贫血、β地中海贫血、δ地中海贫血和γ地中海贫血等。根据临床表现和实验室检测进行地中海贫血的诊断，而血红蛋白电泳的异常是确诊指标。
5. 血红蛋白E病
①HbE纯合子:轻度贫血，脾轻度增大，易感染，血涂片中可有25%～75%的靶形红细胞。血红蛋白电泳显示HbE占75%～92%，无HbA, HbF正常或轻度增加;②血红蛋白E特征:是HbA和HbE基因杂合子，一般无临床症状;血红蛋白电泳, HbE 30%～45%;③HbE/β地中海贫血:血红蛋白电泳显示HbE明显增多并具有地中海贫血的血红蛋白电泳特征。
不稳定血红蛋白病:证明不稳定血红蛋白的存在是诊断本病的主要依据。应用热变性实验、异丙醇实验和变性珠蛋白小体实验可进行不稳定血红蛋白的常规检查，再结合临床表现可进行诊断。做有关珠蛋白链的氨基酸组成分析，可确定不稳定血红蛋白异常的部位。
6. 阵发性睡眠性血红蛋白尿症
PNH是一种获得性造血干细胞基因突变引起红细胞膜缺陷所致的溶血病。PNH的诊断标准(结合1987年我国制订的诊断标准制订) :①临床表现符合PNH或上述必须考虑为PNH的表现情况;②有肯定的血红蛋白尿发作或血管内溶血的直接、间接证据;③实验室检查证明有补体敏感的红细胞群存在:蔗糖溶血实验、热溶血实验、Rous实验为PNH的筛选实验，标准化的酸溶血实验和检测CD55及CD59这两种常见的血细胞表面锚蛋白相关抗原的表达情况是确诊实验。PNH的诊断应注意除外其他溶血病，特别是遗传性球形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血、G6PD缺乏症及阵发性冷性血红蛋白尿症。全血细胞减少还应与再生障碍性贫血鉴别。