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1873年，弗洛伊德以极高的分数考入了维也纳大学医学院。进大学后不久，弗洛伊德就觉得有些失望了。周围的人因为他是犹太人而疏远他，使他置身于不受欢迎的处境。但弗洛伊德从不为自己的出身感到羞耻，他认为对于一个积极者来说，不管别人怎么排挤，仍旧能找到自己的立身之地。这对年纪轻轻的弗洛伊德来说并不是件坏事，他深刻体会了被大多数人压制的命运，这为他以后独立判断力的形成打下了一些基础。
同时，进入大学使他有许多选择的余地，因为这里不仅训练希望成为医生的人，也同样致力于训练进行研究工作的人。弗洛伊德有很长一段时间不明确自己要走上哪条道路。他不停地探索，全神贯注于一些学科，以及研究一些很有收获的理论。
第一学期，弗洛伊德每周要上23小时的课，其中有12小时是解剖学课，6小时是化学课。另外，还要进行这两门课程的实习和实验。第二学期，上课时间增加了5小时，上课的科目包括解剖学、植物学、化学、显微镜实习和矿物学。此外，他还选修了由动物学家克劳斯主讲的“生物学与达尔文主义”，以及恩斯特·布吕克教授主讲的“语态和语言生理学”。布吕克教授是弗洛伊德在学习和研究方面的最重要的一个导师。
弗洛伊德在第三学期选择了弗兰兹·布连坦诺的哲学课。布连坦诺教授的哲学课对弗洛伊德的重要性不能一笔带过。他是奥地利的天主教哲学家，推崇中世纪托马斯·阿奎那所改造的亚里士多德主义，他也是经院哲学的信奉者。布连坦诺的哲学在当时和以后都对西方哲学和心理学界产生了很大的影响。弗洛伊德本人的哲学观点和心理学研究方法虽然有其独特的风格，但也在很大的程度上受到了布连坦诺的影响。弗洛伊德在连续三年听布连坦诺哲学课的过程中，始终没有停止过对别的哲学派别的研究。
弗洛伊德在学习中从不盲从。他并不只是接受别人的观点，而是深入地、创造性地独立思考。为了研究，他如饥似渴地阅读一切能找到的相关的书。弗洛伊德喜爱买书，因为经济的原因，雅各布不得不劝他少买书，两人因此还产生过不愉快。
1875年，弗洛伊德终于有机会到英国去了，这是他长久以来的愿望，因而非常高兴。到英国去的费用是雅各布为奖励他两年前在中学毕业考试中得到“全优”而来的。弗洛伊德在英国与异母哥哥伊曼努尔、侄子约翰和侄女保莲生活了一段时间，他对他们的感情更加深厚了。另一个收获是，弗洛伊德对英国近代革命的领导人克伦威尔有了更加深刻的认识。
第四学期，弗洛伊德决定去上为动物学专业开设的动物学课程，而不满足于只上为医学专业开设的动物学课。所以，他的动物学课程比医学专业的动物学课程多出很多分量。他还要上两个班级的物理学课，比他的同班其他人的物理学课时多一倍。同时，他每周用11个小时的时间上布吕克教授的生理学课。剩余的时间则要用在解剖学上。
维也纳大学
1876年，在克劳斯教授的安排下，弗洛伊德开始进行基础研究活动。1874年，克劳斯教授由德国哥丁根大学来到维也纳大学。克劳斯对海洋动物学有较深的研究。1875年，他在的里雅斯特成立了一所动物实验站，这是全世界第一所动物实验站。他还要求每年要从维也纳大学选派一些优秀的学生到该实验站实习两次，弗洛伊德是第一批被选中的学生。
为了进行这次实验，弗洛伊德必须到亚德里亚海岸进行一次有趣的科学考察。就在这次考察中，弗洛伊德有生以来第一次亲眼看到了欧洲南部的古老文化成果。弗洛伊德一连两学期被选派到动物实验站去，再一次证明了他的优秀。
此前两年，波兰的科学家西蒙·塞尔斯基博士宣布解决了生物学上最老和最令人困惑的问题，即在鳗鱼身上找到了令人难以捉摸的睾丸——一个小小的瓣状突起器官。弗洛伊德首先要做的是验证这个解答是否正确，他在论文中写道：“从没有人发现过一条已经成熟的公鳗鱼，尽管许多年来无数的人在努力，却依然没有人看到过鳗鱼的睾丸。”弗洛伊德在实验室里进行了多次实验，解剖了四百多条鳗鱼，在显微镜下发现了一种小叶状的生殖腺结构。他认为这就是鳗鱼的未成熟的睾丸。
虽然这一发现没有得到验证，但它向解决问题的方向迈进了一大步。
弗洛伊德开始进入布吕克教授开设的生理研究室。恩斯特·布吕克教授身材矮小，有一头红发和一双清澈的蓝眼睛。他是弗洛伊德最敬重的老师。弗洛伊德说：“我终于在恩斯特·布吕克教授的生理研究室找到了归宿，得到了满足，结识了我所敬慕并引以为楷模的师友：伟大的布吕克本人、他的助手西格蒙德·埃克斯纳和恩斯特·弗莱施尔·冯·马克索夫，能与这位很有天赋的弗莱施尔结为好友，我感到不胜荣幸。”
布吕克教授的研究室实际上是享有世界声誉的赫尔姆霍兹医学院的一部分，该学院是全德国最有威望的医学院。而且，研究室也确实解决了一系列生理学和医学上的难题。1874年，布吕克教授发表了《生理学讲义》一书，他在这本书的导言中说：“生理学就是有机体本身的科学。有机体同无生命的但能活动的物体——机器的区别就在于它有同化的能力，但这种能力实际上是整个物质世界所共有的现象。原子系统是通过力运动的，而力的运动是依据由罗伯特·迈尔在1842年发现，然后又由赫尔姆霍兹加以推广的能量守恒定律。力的总和（运动的力和潜在的力）在每一个独立的体系中始终都保持固定。真正的原因就是科学上加以形象化的所谓‘力’。我们关于‘力’知道得越少，我们所加以区分的‘力’的类型就越多：机械力、电力、磁力、光、热等。知识的发展最后把力归结为两种——吸引和排斥。所有这些也同样适用于作为有机体的人。”这也是弗洛伊德从事生理学研究工作的指导思想。
弗洛伊德
弗洛伊德刚进入研究室时，研究室非常破旧。研究室由几间房子组成，室内非常阴暗，连供水系统都没有，只能到院子里的井中打水。布吕克教授交给弗洛伊德一个神经系统组织学方面的研究问题，即研究神经元的内在结构，探讨高等动物神经系统的构成细胞与低等动物的神经细胞的差别。具体要研究的是，八目鳝脊髓中一种特殊类型的大细胞与脊髓的关系。这一种特殊类型的大细胞是由莱斯纳所发现的。布吕克教授希望弄清楚这些神经细胞的组织结构及其生理机能。
弗洛伊德在研究中改进了观察的技术，终于发现莱斯纳所发现的那个细胞“无非就是脊髓神经节”。他在论文中写道：“长期以来，一直认为鱼类的脊髓神经节是双极的，而高等的脊椎动物的脊髓神经节是单极的。”现在，弗洛伊德通过观察，成功地推翻了这个错误的结论。他认为，“八目鳝的神经细胞表明从单极到双极细胞的整个过渡过程”。1878年，弗洛伊德在奥地利科学院发表他的研究论文。后来，这篇论文发表在《生理学学报》上。
弗洛伊德不仅努力研究各个课题，还致力于改进实验方法。之前的实验一直是沿用莱斯尔德制定的显微镜观察方法。运用这个方法观察神经组织时，必须先用硝酸和甘油的混合物来处置被观察的动物。弗洛伊德在研究八目鳝的脊髓神经细胞时，就是采用了这个方法。但他并不拘泥于前人的发明，而是不断研究改进的方法。
弗洛伊德第一次动手改进传统实验技术，是从显微镜的操作方法开始的。经过几年的研究，他发现了新的方法，即用金的氯化物给神经组织染色。他还认识到：科学研究必须把观察同理性思维结合起来。
1879年到1881年，弗洛伊德研究了淡水蟹的神经细胞。在研究中，他采用了当时最先进的技术用显微镜直接观察活组织。
他得出结论说：“神经纤维的轴柱体的结构也是无例外地由原纤维构成的。”在神经生理学史上，弗洛伊德是第一个论证神经纤维的这一特点的人。1882年，弗洛伊德在一次学术报告中又发表了他的重大的研究成果《神经系统的基本结构》。这篇论文论证了神经元是神经系统的基本因素，也是神经纤维的基本结构。
1879年，弗洛伊德义务服兵役。当时，奥匈帝国正同沙皇俄国争夺巴尔干半岛。因此国家规定，每个健康的青年都要服兵役。根据规定，参军的医学院学生只能留在国内服役；如果要派往国外，也只能在医院里服务。弗洛伊德的主要任务是在军医院中值班，他觉得所做的事情索然无味，因此常常不请假就外出。1880年5月6日，弗洛伊德24岁生日这一天，他被关禁闭了。
在弗洛伊德服役期间，有大量的时间可以从事其他工作。于是，他开始进行翻译工作。他首先把英国哲学家约翰·斯图尔特·密尔的著作译成德文，这次翻译工作进行得非常顺利。他所翻译的密尔的五篇著作中，有三篇是涉及社会问题的——劳工问题、妇女解放问题及社会主义问题。
这次翻译工作，还使得弗洛伊德深入学习了柏拉图的哲学。后来，在1933年的一篇著作中，弗洛伊德还提到这次翻译给他带来的影响。他特别提到，柏拉图关于“回想”的学说给了他深刻的印象。弗洛伊德从自己的实际经验出发，改造了柏拉图学说的虚幻性，使它成为发展想象力的一个理论根据。但是，柏拉图学说的虚幻性又使弗洛伊德片面地夸大了精神回忆的作用，忽视了人的实践在回忆过程中的决定性影响。
1881年，弗洛伊德以优异的成绩通过了医学院的毕业考试。在维也纳大学医学院里，弗洛伊德学到了许多宝贵的知识和进行科学研究的正确方法，还结识了许多著名的学者。这为他将来的成功奠定了基础。