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东汉末年，中原军阀割据混战，最后形成魏、蜀、吴三国鼎立局面，敦煌在曹魏的统治下生产有了进一步的发展。西晋虽然有短暂的统一，但很快就是八王之乱（291—306）、永嘉之乱（311），接着是西晋灭亡（316）、晋室南迁（318），北方少数民族入主中原，大批中原的士人逃到河西。十六国时期（304—439），敦煌先后归属于前凉、前秦、后凉、西凉和北凉五个政权。
曹魏在统一北方以后，魏文帝曹丕委任尹奉为敦煌太守，继续维持西汉以来河西屯戍政策。明帝太和元年（227），仓慈继任敦煌太守，抑制豪强势力，抚恤贫穷，鼓励不同民族间通婚，并对来往的西域商人提供贸易和交通的便利，使敦煌社会稳定，生产和商业得到发展
。齐王嘉平元年（249），皇甫隆出任敦煌太守，在敦煌推广中原先进的耕作技术和生产工具，使敦煌的农业生产得到进一步发展
。
前凉（313—376）张氏的统治中心在河西东部的武威，但敦煌仍然是河西政权控制西域的重镇。张骏太元二十二年（345），前凉把敦煌、晋昌、高昌三郡和西域都护、戊己校尉、玉门大护军三营合并，称作沙州，治所在敦煌，以西胡校尉杨宣为刺史
。据敦煌写本唐朝地方官府所修的《沙州都督府图经》卷三记载，杨宣曾组织民众，兴修水利，建五石斗门，堰水溉田，建成长十五里的水渠，百姓为了纪念他的功绩，称作“阳（杨）开渠”。杨宣还用自家的粮食万斛，买石头修理城北北府渠上的平河斗门，保证不再被水冲坏。另外，沙州太守阴澹也曾在城西南修渠，长七里，被称作“阴安渠”
。
前秦（376—387）是由氐族苻氏建立于长安的政权。苻坚建元十二年（376），前秦灭前凉，控制包括敦煌在内的河西。十八年（382），派吕光进攻龟兹。为了巩固经营西域的基地，建元二十一年（385），苻坚迁江汉百姓一万户、中原百姓七千余户到敦煌。大批中原士族和百姓的到来，促进了敦煌耕地的开发和经济的发展。
前秦政权因淝水之战的失败而瓦解。386年，吕光从西域返回河西，在凉州（武威）建立后凉政权（386—403）。麟嘉七年（395），后凉内乱，“武威、张掖已东人西奔敦煌、晋昌者数千户”，继续给敦煌输入人力。后凉敦煌太守孟敏又在州城西南主持修建了长二十里的水渠，人称“孟授渠”
，对当地农业开发起了促进作用。
400年，李暠在敦煌自称凉王，建立了独立于武威后凉政权的割据政权——西凉。这是敦煌历史上第一次成为一个独立政权的都城，据《沙州都督府图经》卷三记载，李暠在敦煌城内修建恭德殿、靖恭堂、嘉纳堂、谦德堂，议朝政，阅武事；又为其父立先王庙；还设立泮宫，增设高门学生五百人
；而于阗、鄯善等西域王国也来遣使朝贡
；敦煌俨然有都城规模。然而，沮渠蒙逊灭后凉建立北凉（401—439）后，对西凉构成巨大威胁。李暠为对付北凉的侵逼，于建初元年（405）迁都酒泉，并随之带走了两万三千人户，使敦煌的实力大为削弱。嘉兴四年（420），北凉打败酒泉的西凉王李歆，西凉灭亡，歆弟恂等曾据敦煌抵抗。421年，沮渠蒙逊亲率二万大军攻敦煌，以水灌城，恂派壮士潜出城外掘堤，均被擒获。李恂最后兵败自杀，蒙逊“屠其城”
。敦煌丁壮被杀，人口减少，更加衰落下去。
由于敦煌的衰微，而北凉的主要对手是立都平城（山西大同）的北魏鲜卑人，所以北凉时期的敦煌没有特别的事迹。北魏太延五年（439），太武帝拓跋焘率军攻占北凉首都姑臧（武威），凉王沮渠牧犍降魏，北凉实际灭亡，但凉王诸弟仍在河西西部进行抵抗。在北魏军队的强大压力下，441年，据守敦煌的牧犍弟无讳，派遣弟安周率五千人西击鄯善，鄯善王比龙拒之，安周不能克。442年，无讳见河西大势已去，自率万余家撤离敦煌，西渡流沙，尚未至鄯善而比龙已西奔且末，其世子投降安周，无讳兄弟占据鄯善。同年八月，无讳留从子丰周守鄯善，率众经焉耆进军高昌。九月，击败高昌太守阚爽，入主高昌城，仍号“河西王”。443年，无讳改元“承平”，建立号称“大凉”的高昌地方割据政权。444年，无讳死，安周即位。由于北凉王族带入高昌的人口过多，引起饥荒，“死者无限”
，这说明北凉王族带走了大批敦煌户口，而且这些人正是因为北魏从东向西的进攻而聚集在敦煌的河西精英。可以说，在北凉灭西凉和北魏灭北凉的过程中，敦煌遭受了前所未有的破坏。
就在沮渠无讳撤离敦煌的442年，西凉李暠的孙子李宝乘机占据敦煌，并派其弟李怀达为使入魏归降。北魏封李宝为沙州牧、敦煌公。但北魏很快就在444年，把李宝召到平城
，直接控制了敦煌，并建立了敦煌镇
，作为经营西域的基地和抗击北方柔然汗国的前沿阵地。太平真君六年（445），北魏太武帝派成国公万度归发凉州以西兵，出敦煌，西击鄯善。九年（448），万度归继续西进，击破焉耆和龟兹，大获驼马而归
。与此同时，以蒙古高原为根据地的柔然，帮助高昌的沮渠安周，在450年攻灭交河的车师国，统一了吐鲁番盆地，车师王车伊洛率残众，经焉耆，最后入魏
。接着，柔然在460年灭掉沮渠安周的大凉政权，立阚伯周为高昌王
。柔然不仅控制了敦煌以西的西域地区，而且直接控制了与敦煌最为接近的吐鲁番盆地。延兴二年至四年（472—474），柔然连年进攻或骚扰敦煌，多者兵力达到三万骑。在敦煌镇将尉多侯、乐洛生的率领下，敦煌军民击败了来犯的敌军，保住了敦煌
。但严峻的形势使得不少政府官员建议放弃敦煌，把北魏边界后撤到凉州。给事中韩秀认为，如果放弃敦煌，不仅凉州不能保，恐怕关中也不得安宁
。孝文帝坚决支持韩秀的看法，升敦煌镇将为都大将，以加强敦煌的守备力量。太和九年（485）以前，任敦煌镇都大将的穆亮，“政尚宽简，赈恤穷乏”
，使敦煌得到恢复。同时，叛离柔然的高车族在高昌西北立国，487年击败柔然。488年，柔然所属的伊吾戍主高羔子投降北魏。492年，北魏出十万大军，击败柔然，使敦煌由此得到安宁。但长年的征战和人口的流失，很难在短期内恢复。神龟年间（518—520），凉州刺史袁翻说敦煌、酒泉“空虚尤甚”
，所以建议加强河西的屯田，说明了敦煌当时衰落的情形。
正光五年（524），北魏的北方边镇爆发“六镇起义”。八月，孝明帝下诏：“诸州镇军贯，元非犯配者，悉免为民，镇改为州，依旧立称。”
敦煌因盛产美瓜而取名“瓜州”（一度易名“义州”），领敦煌、酒泉、玉门、常乐、会稽五郡，治敦煌
。六镇起义也引起河西动荡，为加强河西西部的统治，孝昌元年（525），北魏以明元帝四世孙元荣出任瓜州刺史。永安二年（529），又封元荣为东阳王。瓜州偏处边陲，没有受到北魏末年中原动乱的太大影响。534、535年，东、西魏分立，河西属于西魏的版图，元荣又作为西魏的瓜州刺史，一直到大统十年（544）。在元荣统治敦煌的近二十年中，他团结敦煌豪右，使境内保持安定。元荣曾出资写经十余部，有数百卷之多（图2），又在莫高窟开凿大型石窟，这些行事反映了敦煌经济文化的恢复和发展
。
图2 P.2143东阳王写经
元荣卒，其子元康继任瓜州刺史，但元荣的女婿邓彦（又作季彦）杀康，自立为刺史，西魏不得已而承认
。大统十一年（545），西魏河西大使申徽至敦煌，在大族令狐整等人的协助下，擒获邓彦，送京师治罪。546年，申徽被任命为瓜州刺史。申徽为政勤俭，百姓得以安居乐业。
557年，宇文觉废西魏，立北周，与550年高洋废东魏所立的北齐对垒。大约565—576年任瓜州刺史的建平公于义，继续元荣在敦煌莫高窟的开窟造像活动，敦煌碑记中因称“建平、东阳弘其迹”
。建德三年（574），北周武帝曾下诏灭佛，但对瓜州的影响似乎不大。