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环游世界使欧洲人看到了各种不同的宗教观点，而宗教观点在欧洲本土也开始变得多样化。1517年标志着基督教内部开始出现一种深刻的、往往伴随着暴力的持续分裂。那一年，奥古斯丁会的神职人员和神学教授马丁·路德（1483——1546）在维滕贝格大学城提出了著名的《九十五条论纲》。这些论纲或命题以经院论辩主题的格式写成，集中批判了当地出售赎罪券的不当做法，这种做法在神学上是站不住脚的。虽然关于仪式和教义问题的类似争论在中世纪大学的论辩文化中很常见，但路德的抗议超出了神学学术争论的通常界限，迅速演变成一场超出马丁·路德控制的、有广泛基础的政治社会运动。路德的主张最初很温和，但逐渐变得越来越大胆和有对抗性，从地方做法的一些小问题升级为严重的教义问题。这些主张经由印刷机迅速传播开来，因与地方民族主义的联系而加深，并且受到了德国统治者的唆使，他们认为脱离罗马对其政治利益有利。就这样，一次地方性的抗议（protestation）出乎预料地发展成了新教（Protestantism）。新教几乎立刻分裂成了若干相互争论不休的派别。除了天主教与路德教的争论，很快又出现了路德教与加尔文教的争论，然后是加尔文教内部的争论，等等。所谓的“宗教战争”——激励它的往往更多是政治和王朝的操纵，而不是教义问题——在接下来的一个半世纪里震撼着欧洲，特别是德国、法国和英国。
路德本人并非人文主义者，尽管他的一些理念，如强调对《圣经》的字面理解而不是天主教徒所青睐的隐喻读法，与人文主义者对文本的强调有相似之处。但比这些相似之处更重要的是他怀疑古典的（“异教的”）文献和思想，并且希望把《圣经》中那些不同于其个人观念的各卷（如《雅各书》）删除。然而，比他有学识得多的梅兰希顿（1497——1560）却完全不是这样。“梅兰希顿”这个名字证明了他的人文主义，它是从原本粗野的德国“黑土地”（Schwartzerd）翻译成的古典希腊文。提出这种“自我古典化”的是他伟大的伯父、德国最引人注目的人文主义者罗伊希林。紧随路德对大学经院哲学的拒斥，梅兰希顿（作为一个同样不喜欢经院哲学的人文主义者）调整了从天主教皈依路德教的德国大学——特别是路德本人所在的维滕贝格大学——的课程设置和教学。他设计的新课程使他赢得了“日耳曼之师尊”的头衔。其方法并非驱逐亚里士多德，而是——以真正人文主义的方式——消除中世纪向亚里士多德所作的“增添”以及使用更佳版本的希腊哲学家著作。新兴的新教大学不得不重新开始，淡化业已确立的方法，从而能把在旧体制中无法立足的新的主题和研究方法包括进来。
天主教内部的改革运动也在进行。在15世纪，宗教会议解决了一些问题，虽然不是很成功。更引人注目的是特伦托会议（1545——1563），这次大公会议通过处理腐败问题、澄清教义、规范仪式、集中纪律监督等做法，对新教作出了回应。直到第二届梵蒂冈大公会议（1962——1965），特伦托会议一直是中世纪之后最重要的教廷会议，它拉开了天主教改革或者说“反宗教改革”的序幕。其措施包括改进教士的教育（这一改革是许多人文主义者所提倡的）以及加强对于发表作品中正统学说的监督。一个新组建的教士团体——耶稣会最积极地参与到了特伦托会议所倡导的改革之中。1540年，圣依纳爵·罗耀拉在教皇的授权下建立了耶稣会，耶稣会士们尤其致力于教育和学术，在科学、数学和技术等领域做出了重要贡献。
除了宣扬新教徒回归天主教，耶稣会士更广泛的影响在于他们在创会最初几年所建立的数百所学校和学院。耶稣会的教育基于一种新颖的教学和课程风格，它坚持了亚里士多德方法的重要性，但重新强调了数学（到1700年，耶稣会士占据着欧洲一半以上的数学教授职位）和科学。科学革命的一些新科学思想往往是在耶稣会学校最先讲授的，许多蕴育这些观念的思想家便是在这些学校培养出来的。耶稣会士沿着新开辟的贸易路线前往世界各地，高姿态地进入了中国、印度和美洲（当然包括开办学校），建立了第一个全球性的通信网络。该网络把一切事物都带回了罗马，无论是生物标本、天文观测和文化制品，还是关于本土知识和风俗的广泛报道。耶稣会对于研究科学和数学的态度表达了它的座右铭：“在万事万物中找到神。”虽然耶稣会士强调这种激励，但这并非他们所独有，而是几乎整个科学革命的基础。