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1926年7月1日，广州国民政府发表《北伐宣言》，7月9日又在广州东校场举行10万军民参加的誓师大会。国民革命军总司令蒋介石发表就职宣言。随后，13万国民革命军分为西、中、东3路，浩浩荡荡地向湖南、湖北、江西、福建、浙江出发进行北伐。参加北伐的8个军，分别由何应钦、谭延闿、朱培德、李济深、李福林、程潜、李宗仁、唐生智担任军长。
叶剑英原在第一军的第二十师，王柏龄任总预备队指挥官后，又把叶剑英要到总预备队指挥部当了参谋长。他协助王柏龄指挥第一、第二两个师，经过郴州、衡阳、长沙，到达岳州驻守。
由于官兵们的英勇作战，由于共产党人的积极参战和广大工农群众的大力支援，北伐军激战贺胜桥、夺取汀泗桥，不到两个月的时间，就攻克汉阳、汉口，开始了对武昌的围攻。
这时，在南昌的孙传芳集中5个省的联军10万余人到江西，准备与北伐军作战。担负攻打南昌的，是程潜第六军第十九师，王柏龄、叶剑英奉命率总预备队的第一师，经浏阳、铜鼓，前往南昌增援。
第一次打南昌很顺利。工人、学生及省署警备队作为内应，北伐军经过激战进入城内。但孙传芳凭借优势兵力和军舰，并坐镇指挥，又很快将南昌夺了回去。北伐军在牛行车站附近与孙部争夺，伤亡惨重。
总司令蒋介石和苏联顾问加伦将军到达前线。加伦将军听取情况介绍，提议休整两周时间，调整部署后再战。叶剑英也同意加伦的意见，力劝王柏龄暂时休整再战。但王柏龄为了挽回坐失南昌的面子，也为了在蒋介石面前表现自己，急忙下令部队反攻，以至造成孤军突进，失利败回。后来蒋介石虽然直接指挥，也没有把南昌攻下来。
第三次打南昌是10月上旬开始的。第一师代师长王俊没听协助他指挥的叶剑英的建议，先打了一个消耗战。直到10月下旬，战局仍然进展不大。蒋介石制订了《肃清江西计划》，又调李宗仁第七军与李济深第四军、程潜第六军协同作战，并出动飞机大炮，才于11月上旬占领了南昌。
蒋介石的总司令部移住南昌后，先把王柏龄、王俊等人痛骂了一顿，接着召见叶剑英。
叶剑英连饭也没吃，并做好了挨骂的思想准备，一大早就赶到蒋介石总司令部官邸。
谁知叶剑英一去，蒋介石却很客气，不仅特别允许他佩剑晋见，脸上还流出少见的笑容，亲热地说：“我们是老交情了。”
1927年，叶剑英在江西吉安毅然通电反蒋
对蒋介石的反常举动，叶剑英一时摸不着头脑，因此没有说话。
蒋介石：“两次东征，你在军事上很有见地，由于你的参谋，张民达师多有战绩。”
叶剑英：“还是张师长指挥有方。”
蒋介石：“张民达故去后，我调你去教导师，这次又到总预备队指挥部。这一路来茂如(王柏龄)不争气，你辛苦了!”
这话并不完全是虚伪，叶剑英劝说王柏龄和王俊的事，蒋介石已经知道了。他欣赏叶剑英的才干，因而这般器重他了。
叶剑英：“我只尽了一点参谋之责，不足挂齿!”
蒋介石：“你是个很有用的参谋人才。现在第一师没人指挥，你去当师长吧。”
一师是蒋介石的嫡系，那里的师长是只有亲信才能当的。蒋介石让叶去当师长，一是确实想利用叶的才干，二是王柏龄是他的亲信，早在黄埔军校筹建时，王就对蒋说叶是他的得意门生。王很重视叶，因而蒋也就把叶视作亲信了。
叶剑英自然看到了这些，但他仍然不愿去第一师当师长。他知道那里的部下不好管束，与王柏龄、王俊的关系不好处，因而婉言谢绝说：“谢谢校长的栽培，可我的身体不大好，还愿继续当参谋长。”
可是没几天，蒋介石把俘虏孙传芳的万余士兵和数百名军官组成新编军，又下令叶剑英为新编二师的代理师长。这一次，叶剑英不好再拒绝了，走马上任了。
随后，叶剑英奉命率二师部队开赴吉安。
中山舰事件爆发后，国共两党的斗争已经日趋激烈。吉安是一个远离南昌的幽静古城。在这里，叶剑英密切关注着时局的发展，注视南昌和武汉的动向，做着自己的人生抉择。
1927年1月，蒋介石在南昌召开军务善后会议，对抗国民党中央，决定中央党部和国民政府暂住南昌，准备另立中央，公开反共。
4月12日，蒋介石在上海发动反革命政变，开始屠杀中国共产党人。
4月16日，周恩来等人建议出师东征讨伐蒋介石。
4月17日，武汉国民政府和国民党中央发表声明，开除蒋介石国民党党籍，免去其所任职务，委任冯玉祥为军队总司令。在南京的蒋介石也公开反对武汉政府。因此，出现了“宁汉分裂”的政治局面。
是归向南京还是归向武汉？两条路摆在叶剑英的面前。1927年4月，叶剑英毅然做出了他的选择：倒向武汉方面。
选择后的第一个行动，就是通电反对蒋介石。
叶剑英召集全师军官会议，当众宣读了他的反蒋电文，慷慨激昂地说：“兄弟们，以前我拥护蒋介石，他是我们的校长和总司令，主张联合民众，所以我们跟着他革命。可是现在他不革命了，背叛了中山先生的遗嘱，公开反对主张北伐的武汉国民政府，在上海、南京和其他地方屠杀工农民众。他叛变革命，我们就要反对他!我想了又想，几夜没有睡好觉，如今想好了，决定与老蒋分道扬镳!诸位如何打算，人各有志，我不勉强，愿意革命的，留下；拥护蒋介石的，也请自便!”
通电发出之后，叶剑英带着几个人，化了装秘密赶往武汉。
蒋介石刚刚才任命叶剑英做了师长，哪相信叶剑英会反对他？但是反蒋电文却是千真万确的。他得到证实叶剑英反他后，立即让国民党中央执行委员会永远开除了叶剑英的国民党党籍。