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蔡元培在任10年间，北洋政府总统换了5次、内阁总理换了30次。时局动荡下，他也一再强调读书不忘救国，救国不忘读书，核心是读书。
1919年的4月30日，巴黎和会突然传来令人震惊的密电，和会拟将德国在山东的权益转交给日本，中国代表团因无力对抗，即将在和约签字。情急之下，时任外委会委员长的汪大燮亲自坐马车赴东堂子胡同的蔡宅，把密电的内情告诉了蔡元培。
蔡元培当即召集北大学生，主要是新潮社、国民社的学生，希望他们能够行动起来，以一己之力阻止巴黎和会的代表签字。
1919年5月4日，星期天，北大学生在红楼后集合，准备上街游行。虽然教育部的代表和京师警察厅在北大门口试图阻拦学生队伍，但队伍很快冲破阻拦，整队出发。
蔡元培后来的《我在北京大学的经历》一文中说：“民国七年（1918）夏间，北京各校学生，曾为外交问题，结队游行，向总统府请愿；当北大学生出发时，我曾力阻他们，他们一定要参与；我因此引咎辞职，经慰留而罢。”但是， “到八年（1919）五月四日，学生又有不签字于巴黎和约而罢免亲日派曹、陆、章的主张，仍以结队游行为表示，我也就不去阻止他们了。 ”
随后势态急转直下，一场阻止中国代表团在巴黎和会上签字的五四游行示威活动演变成一场运动。当天群情激愤的北大学生火烧了曹汝霖的住宅，并痛殴了章宗祥。32名学生在与政府的激烈对抗中被捕。被逮捕的学生中，北大学生居多数。当学生被捕的消息传来，蔡元培立即投入了营救工作。当晚，北大学生群集在三院大礼堂商讨对策。蔡元培发言时说：“我做校长的有责任保护我的学生。我要救出这三十几个学生来。你们现在都回教室，我保证尽我最大的努力。”他漏夜前去请政坛元老孙宝琦出面，在孙家客厅从 9点坐到 12点，直到孙答应为止。
5月5日，教育部下令要求各校校长将为首滋事学生一律开除。这显然超出了蔡元培的意料。当天下午，蔡元培等14所大专院校校长在北大开会，认为“若指此次运动为学校运动，亦当由各校校长负责”，蔡元培表示“愿以一人抵罪”，当场议决成立校长团，向当局请愿营救被捕学生。
5月7日，迫于全国舆论压力，政府释放了被捕的学生。蔡元培亲自率领全体师生到红楼前的广场迎接。
北洋政府认为蔡元培是学潮的幕后指使人，内阁会议上有人提出解散北大，撤换蔡元培等主张。教育总长傅增湘也遭到众人指责。最耸人听闻的传闻是：总统徐世昌要严办北大校长，安福系军阀要刺杀蔡元培；陆军次长徐树铮已命令军队将炮口对准北大。
“但被拘的虽已保释，而学生尚抱再接再厉的决心，政府亦且持不做不休的态度。都中喧传政府将明令免我职而以马其昶君任北大校长，我恐若因此增加学生对于政府的纠纷……不可以不速去。 ”
被捕学生安全返校，在学生欢庆胜利的热闹中，蔡元培再次开始撰写他入主北大后的第三份辞呈。
5月9日晨，正是五四运动进入高潮之际，蔡元培不辞而别，离京出走。蔡元培临走前留下一个启事：“我倦矣！‘杀君马者道旁儿。’‘民亦劳止，汔可小休’。我欲小休矣！北京大学校长之职，已正式辞去；其他向有关系之各学校、各集会，自五月九日起，一切脱离关系。特此声明，惟知我者谅之。 ”
第二天，蔡元培的辞职启事见诸京城各大报端。
“杀君马者道旁儿”是一个典故，这个典故的意思就是说，路旁的人给一匹跑得很快的马不停鼓掌欢呼，这匹马就会不停地加速，最终马会被累死。正如鲁迅所言，在中国，鼓掌会鼓死人的，是谓“捧杀”。在蔡先生看来，目前的北大也有这种味道。北大在新文化运动中狂奔突进，大家都跟着它欢呼，它也越跑越快。而且在五四运动中，学生们也取得了胜利，学生们影响社会的能力体现出来了，所以那个时候他就有个预感，以后的北大“不好管”了。
蔡元培自执掌北大以来，并不反对学生关心政事，“读书不忘救国”是他的名言。1919年5月2日，他还在北大饭厅召集学生代表开会，号召奋起救国。第二天，他知道了政府已同意在巴黎和约上签字这一消息，当刻召来并告知罗家伦、傅斯年等学生代表。蔡元培在明确政府无所作为的情况下，当时确有“将希望寄托在爱国学生身上”的想法。因此他对学生游行是支持的。
但五四运动的发展出乎他的意料，火烧赵家楼、殴打章宗祥的暴力行动，显然不符合蔡元培的教育原则。5月4日晚，他参加了北大三院的学生集会，慨然应允全力营救被捕学生，但也苦劝学生不要再开会，希望他们照常上课，以免“节外生枝，增加营救的困难”。学生们并没有听他的，第二天便联合北京其他高校一同罢课。
事态已然如此，蔡元培觉得自己有负北大校长的职责。他已生去意。
他的立场与学生不同，世界上没有哪一个校长会情愿自己的学生罢课。蔡元培讲“读书不忘救国，救国不忘读书”，一个“文化救国论”者，显然不希望自己的学生成为“职业革命家”。
就这样，蔡元培离京南下。
风雨如晦的近代中国，一位大学校长如何端平政治和书桌这个难题，并不只是摆在蔡元培一个人的面前。
北大学生得知蔡元培辞职的消息后，立即召集代表会议，议决致函傅增湘，要求“万勿允准辞职”，“以维学务而平舆情”。
北大教职员亦召开全体会议，作出“如蔡不留，即一致总辞职”的决议，并推举李大钊、马叙伦、马寅初等8人为代表赴教育部，要求政府挽留蔡先生。在声势浩大、长达数月的北大师生的挽留中，蔡元培又回了北大。但改革之初的甜蜜和宁静仿佛不复再有，改革巅峰的繁华和美景也仿佛不复再有。
许多年之后，蔡元培在《我在北京大学的经历》一文中写道：我对于学生运动素有一种成见，以为学生在学校里面应以求学为第一目的，不应有何等政治的组织。年在 20岁以上者，对于组织有特殊兴趣者，可以个人资格参加政治团体，不必牵涉学校。
蔡元培认为，学生在大学里，研究学问始终是第一位的，始终不愿学生涉足政治。正如前文所提，早在 1917年 1月 9日，他在北大发表首次演说就提到：“大学是研究高深学问的地方，学生进大学不应仍抱科举时代思想，以大学为取得官吏资格之机关。应当以研究学术为天责，不当以大学为升官发财之阶梯。必须抱定为求学而来之正大宗旨，才能步入正轨。 ”
他本人在北大也不想涉足政治。1917年3月15日，蔡元培担任北大校长不久，在写给汪精卫的信里说：“弟进京后，受各政团招待时，竟老实揭出不涉政界的决心。”1918年1月14日，他写信给吴稚晖：“弟虽在京师，然誓不与闻政治，至今已成习惯，惟校务太忙，无暇读书，亦终日为人役耳。”1925年5月13日，他给胡适回信：“承示北大当确定方针，纯从研究学问方面进行，弟极端赞同。”他说的是肺腑之言，也是他一直想做的，却因时局的动荡，始终没有做到。
1924年12月4日，他给北大毕业的傅斯年、罗家伦写信，口口声声自称“弟”，而不是以师长自居，说到北大，他说：“校中同人往往误以‘天之功’一部分归诸弟，而视弟之进退为有重要之关系。在弟个人观察实并不如此……然弟始终注重在‘研究学术’方面之提倡，于其它对外发展诸端，纯然由若干教员与若干学生随其个性所趋而自由申张，弟不过不加以阻力，非有所助力也……现在如国学研究所等，稍稍有‘研究’之雏形者，仍恃有几许教员、几许学生循其个性所趋而自由申张，弟亦非有所助力也。 ”
他说自己研究学术的兴趣随年而增加，所以也鼓励学生研究学术。但他从不主张学生死读书，而是支持学生参加各种社团活动。认为通过学生自治，“由学生传之各地方，一定可以提起国民自治的精神”。傅斯年、罗家伦以后分别做过北大、清华的校长，当年都是学生社团的积极分子，也是五四游行的发起者。
提倡学生参与社团，蔡元培还有一个用意，就是针对腐败的旧习惯。他在《我在教育界的经验》中自述：提倡进德会（此会为明国元年吴稚晖、李、张溥泉、汪精卫诸君发起，有不赌、不嫖、不娶妾的三条基本戒；又有不作官吏、不作议员、不饮酒、不食肉、不吸烟的五条选认戒），以挽奔竞及游荡的旧习；助成体育会、音乐会、画法研究会、书法研究会，以供正当的消遣；成立消费公社、学生银行、校役夜班、平民学校、平民讲演团与《新潮》等杂志，以发扬学生自动的精神，养成服务社会的能力。
据当年的学生顾颉刚后来回忆：“北大学生本来毫无组织，蔡先生来后，就把每班的班长召来，劝他们每一系成立一个学会……靠了蔡先生的敦促和领导，以及学校在经费上的帮助，许多会居然组织起来了。不但每系有会，而且书法研究会、画法研究会、音乐会、辩论会、武术会、静坐会……校中尽有消遣的地方，打牌听戏的兴致也就减少了许多。 ”
1918年初，画家陈衡恪到北大作讲座，之后成立了“画法研究会”。2月4日，蔡元培写给陈衡恪的信中说：“日前承临校讲演，同人甚为感动。现在报名于画法研究会者，已有七十余人。拟刻期开办，惟会章须请先生审定，然后宣布。 ”
同年10月20日，北大学生邓中夏、许德珩、段锡朋、周炳琳等发起“国民社”，蔡元培亲自出席成立大会，并为《国民》创刊号写序。12月3日，北大学生傅斯年、罗家伦、毛子水、俞平伯、顾颉刚、朱自清、冯友兰等成立新潮社，出版《新潮》杂志，蔡元培亲自题写刊名，经他和陈独秀同意，由学校垫付印刷费，提供北大红楼一层二十二号作为社址，发行也由学校出版部兼办。
据罗家伦回忆，蔡先生这个人虽然懦懦弱弱、有求必应，但是在大节上面确实很强硬。有人拿了《新潮》杂志给总统徐世昌，徐发现里面有一篇《女子贞操问题》，大怒，说：“现在青年思想到这个地步，还得了！”立刻把傅增湘找来，说要查办北大。傅增湘授意蔡先生，要他辞退复古派眼里的“北大四凶”陈独秀、胡适、傅斯年、罗家伦，他始终不肯，并以去就力争。
其实，北大既有主张白话文、新思潮的《新潮》，也有主张文言文、昌明中国固有学术的《国故》，由刘师培、黄侃等老师支持部分学生创办，同样得到校方支持。1919年4月2日，蔡元培在回复傅增湘的信中说：“敝校一部分学生所组之《新潮》出版以后，又有《国故》之发行，新旧共张，无所缺倚。在学生则随其好尚，各尊所闻。当事之员，亦甚愿百虑殊途，不拘一格以容纳之。局外人每于大学内情有误会之处……大学兼容并包之宗旨，实为国学发展之资。 ”